Procedimiento in vitro para el pronóstico de la progresión de un cáncer y del resultado en un paciente y medios para llevar a cabo dicho procedimiento.

Un procedimiento in vitro para el pronóstico del tiempo de supervivencia de un paciente que padece un cáncer,

en el que dicho procedimiento es mediante la medición del nivel de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente,

en el que una respuesta inmune adaptativa fuerte se correlaciona con un pronóstico del cáncer favorable y una respuesta inmune adaptativa débil se correlaciona con un pronóstico pobre y

en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

a. llevar a cabo una cuantificación de la densidad celular de células GZM-B+ en muestras de tejido tumoral recogidas de dos regiones separadas del tumor de dicho paciente, respectivamente (i) el centro del tumor (CT) y (ii) el borde invasivo del tumor (IM), y

b. llevar a cabo las etapas de comparación siguientes:

i. comparar el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para células GZM-B+ en CT con un valor de referencia CT predeterminado para células GZM-B+, y

ii. comparar el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para células GZM-B+ en IM con un valor de referencia IM predeterminado para células GZM-B+, y

en el que cuando el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para células GZM-B+ en CT es mayor que el valor de referencia CT predeterminado para células GZM-B+ y el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para células GZM-B+ en IM es mayor que el valor de referencia IM predeterminado para células GZM-B+, entonces se determina un pronóstico de resultado favorable para dicho cáncer y cuando el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para células GZM-B+ en CT es menor que el valor de referencia CT predeterminado para células GZM-B+ y el valor de cuantificación obtenido en la etapa a) para células GZM-B+ en IM es menor que el valor de referencia IM predeterminado para células GZM-B+, entonces se determina un pronóstico de resultado pobre para dicho cáncer.

Procedimiento in vitro para el pronïstico de la progresiïn de un cïncer y del resultado en un paciente y medios para llevar a cabo dicho procedimiento Sector de la invenciïn La presente invenciïn se refiere al sector del pronïstico del resultado de un cïncer en un paciente.

Mïs precisamente, esta invenciïn se refiere al pronïstico del resultado de un cïncer en un paciente, cuyo pronïstico se basa en la cuantificaciïn de uno o varios marcadores biolïgicos que son indicativos de la presencia de, o alternativamente el nivel de, la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente contra dicho cïncer.

Antecedentes de la invenciïn Dado que el cïncer es la segunda causa de mortalidad, en particular en Europa y en Estados Unidos, se estïn invirtiendo una gran cantidad de esfuerzos y recursos econïmicos en el desarrollo de estrategias terapïuticas nuevas. Sin embargo, la necesidad de herramientas de diagnïstico y pronïstico fiables es una etapa limitante de la aplicaciïn exitosa de una terapia de cïncer. La mejor forma de manifestarlo es mediante el hecho de que la mayor parte de los marcadores de cïncer conocidos actualmente son muy poco fiables.

En la actualidad, los tumores malignos se clasifican generalmente segïn el sistema TNM. El sistema de clasificaciïn TNM (para “Tumor-Node-Metastasis”, "Tumor-Ganglio-Metïstasis”) utiliza el tamaïo del tumor, la presencia o ausencia de tumores en ganglios linfïticos regionales, y la presencia o ausencia de metïstasis distantes, para asignar un estadio al tumor (AJCC Cancer Staging Manual (“Manual de estadificaciïn del cïncer de la AJCC”) , Lippincott, 5ï ediciïn, pïgs. 171-180, 1997) . El estadio asignado se utiliza como base para la selecciïn de una terapia apropiada y para propïsitos de pronïstico. Cuando se aplica para la estadificaciïn de cïnceres colorrectales, el sistema TNM permite la distinciïn entre (T) el grado de invasiïn de la pared intestinal, que oscila entre T0 y T4,

(N) el grado de implicaciïn de ganglios linfïticos, que oscila entre N0 y N3 y (M) el grado de metïstasis, que oscila entre M0 y M1.

Para cïnceres colorrectales, tambiïn se puede asignar un estadio al tumor segïn la clasificaciïn de Dukes. La clasificaciïn de Dukes permite la distinciïn, como mïnimo, entre cuatro estadios de tumor principales, respectivamente (A) tumor confinado en la pared del intestino, (B) extensiïn del tumor a travïs de la pared del intestino, (C) implicaciïn de ganglios regionales y (D) existencia de metïstasis distante.

Sin embargo, las clasificaciones clïnicas anteriores, aunque son ïtiles, son imperfectas y no permiten un pronïstico fiable del resultado de los cïnceres. Esto es particularmente cierto para los cïnceres asignados como Clase B de Dukes, que son de una gran variedad de gravedad.

En lugar de la estadificaciïn clïnica convencional, en la tïcnica se han dado a conocer una gran cantidad de marcadores biolïgicos, entre los que se incluyen genes y proteïnas, que serïan potencialmente ïtiles para el diagnïstico o el pronïstico de una gran variedad de cïnceres. De forma destacable, se han dado a conocer diversos procedimientos para proporcionar patrones de expresiïn gïnica que serïan potencialmente ïtiles como herramientas para el diagnïstico o pronïstico del cïncer, incluyendo para el diagnïstico o pronïstico de cïnceres colorrectales.

En este contexto, diversos trabajos de la tïcnica anterior se dirigieron hacia la demostraciïn de una relaciïn entre (i) la presencia de, o el nivel de expresiïn de, diversos marcadores biolïgicos de la respuesta inmune del huïsped y (ii) la existencia de un cïncer o el estadio de desarrollo de un cïncer, principalmente con el objetivo de descifrar los mecanismos que sustentan la evasiïn de la respuesta inmune por parte de los tejidos tumorales, y finalmente con el

objetivo de sugerir estrategias de inmunoterapia contra el cïncer adecuadas.

De forma ilustrativa, Nistico et al. (1999, Int. J. Cancer, Vol. 84: 598-603) sugirieron la existencia de una respuesta inmune espontïnea contra el producto del oncogïn erbB-2 en una paciente con cïncer de mama HLA-A2 positivo, la eficacia de la cual serïa dependiente de la expresiïn de la molïcula HLA de clase I del tumor y de la localizaciïn de linfocitos T CD3+, es decir, en tejido intratumoral (IT) o peritumoral (PT) . Segïn dichos autores, estos resultados 45 podrïan conducir a la identificaciïn de nuevos parïmetros que podrïan ser ïtiles para definir estrategias inmunoterapïuticas mïs especïficas y mïs eficaces contra el cïncer de mama.

Philips et al. (2004, British Journal of Surger y , Vol. 91: 469-475) han demostrado que linfocitos infiltrantes de tumor en cïncer colorrectal con inestabilidad de microsatïlites estaban activados y eran citotïxicos, mediante el ensayo de (i) las proporciones de ARNm de CD8 / CD3 y (ii) la producciïn de CD3, CD4, CD8, IL-2Rα y la proteïna Granzima B

en el tejido tumoral, aunque no existïa una correlaciïn significativa entre los nïmeros de copia del ARNm de los marcadores de cïlulas T y los conteos inmunohistoquïmicos. Dichos autores sugirieron que, en cïncer colorrectal con inestabilidad de microsatïlites, se podïan producir pïptidos mutados inmunogïnicos, que inducirïan una respuesta inmune antitumoral, y concluïan que dicho modelo de cïncer podrïa ayudar en la comprensiïn de las interacciones huïsped-tumor, con el objetivo de mejorar las estrategias inmunoterapïuticas de forma destacada.

Maki et al. (2004, J. Gastroenterology and Hepatology, Vol. 19: 1348-1356) habïan demostrado un deterioro del sistema inmune celular en pacientes con carcinoma hepatocelular, que se evaluaba por una expresiïn reducida de las proteïnas CD3ζ y CD28 por parte de las cïlulas T, asï como por una actividad caspasa-3 aumentada en cïlulas T con modulaciïn descendente por CD28, sugiriendo la existencia de apoptosis de cïlulas T en pacientes HCC. Segïn dichos autores, se podrïa establecer una nueva modalidad de terapia inmune antitumoral, que estarïa dirigida a la activaciïn de dichas cïlulas T y a evitar su apoptosis. Grujil et al. (1999, British Journal of Cancer, Vol. 79 (7/8) : 1127-1132) tambiïn habïan informado acerca de una expresiïn reducida de CD3ζ en carcinoma cervical infiltrante de cïlulas T. Dichos autores sugirieron que, a efectos de que las estrategias de vacunaciïn fueran satisfactorias, deberïa ser esencial identificar, en primer lugar, y contrarrestar los mecanismos que conducen a esta pïrdida de CD3ζ.

El deterioro de la respuesta inmune del huïsped, mediante la evaluaciïn de la expresiïn de las proteïnas CD3, CD4, CD8 y ligando Fas en linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) , tambiïn se demostrï en pacientes con carcinoma oral (Reichert et al. (2002, Clinical Cancer Research, Vol. 8: 3137-3145) ) . Prado-Garcïa et al. (2005, Lung Cancer, Vol.

47: 361-371) que realizaron observaciones similares, habïan estudiado mecanismos de evasiïn de adenocarcinoma de pulmïn midiendo los porcentajes de cïlulas CD3+, CD4+ y CD8+ en sangre perifïrica y la efusiïn pleural, y adicionalmente la expresiïn de proteïnas CD27, CD28, CD45RO, CD45RA, granzima A, Fas y perforina en los subconjuntos de cïlulas T CD8+. Dichos autores habïan encontrado un bloqueo de la respuesta inmune y sugirieron que eran necesarios estudios adicionales para la comprensiïn de los diversos mecanismos mediante los cuales las cïlulas de adenocarcinoma inhiben las cïlulas T CD8+ en los procesos de iniciaciïn, crecimiento e invasiïn del carcinoma de pulmïn, con el objetivo de desarrollar tratamientos mejorados para enfermedades malignas de pulmïn.

Kuss et al. (2003, British Journal of Cancer, Vol. 88: 223-230) que realizaron observaciones similares, determinaron un subconjunto extendido de cïlulas T efectoras CD8+CD45RO-CD27 dotadas de una seïalizaciïn TcR disfuncional, en pacientes con carcinoma de cïlulas escamosas. Estos autores sugirieron estudios adicionales para confirmar directamente la hipïtesis que unirïa los defectos de seïalizaciïn observados con la apoptosis y la rïpida renovaciïn de linfocitos en pacientes con cïncer.

Ademïs, Valmori et al. (2002, Cancer Research, Vol. 62: 1743-1750) han descubierto la presencia de un subconjunto de cïlulas T CD45RA+CCR7-CD8+ PBL que tiene una actividad citolïtica en pacientes con melanoma. Dichos autores sugirieron que una vacunaciïn antitumoral mejorada deberïa estar dirigida hacia la estimulaciïn y mantenimiento de dicha respuesta inmune efectora en un estadio temprano de la evoluciïn de la enfermedad, en un momento en el que una respuesta de este tipo podrïa ser eficaz para erradicar una... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para el pronïstico del tiempo de supervivencia de un paciente que padece un cïncer,

en el que dicho procedimiento es mediante la mediciïn del nivel de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente,

en el que una respuesta inmune adaptativa fuerte se correlaciona con un pronïstico del cïncer favorable y una respuesta inmune adaptativa dïbil se correlaciona con un pronïstico pobre y

en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

a. llevar a cabo una cuantificaciïn de la densidad celular de cïlulas GZM-B+ en muestras de tejido tumoral recogidas de dos regiones separadas del tumor de dicho paciente, respectivamente (i) el centro del tumor (CT) y (ii) el borde invasivo del tumor (IM) , y

b. llevar a cabo las etapas de comparaciïn siguientes:

i. comparar el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) para cïlulas GZM-B+ en CT con un valor de referencia CT predeterminado para cïlulas GZM-B+, y

ii. comparar el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) para cïlulas GZM-B+ en IM con un valor de referencia IM predeterminado para cïlulas GZM-B+, y

en el que cuando el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) para cïlulas GZM-B+ en CT es mayor que el valor de referencia CT predeterminado para cïlulas GZM-B+ y el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) para cïlulas GZM-B+ en IM es mayor que el valor de referencia IM predeterminado para cïlulas GZM-B+, entonces se determina un pronïstico de resultado favorable para dicho cïncer y cuando el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) para cïlulas GZM-B+ en CT es menor que el valor de referencia CT predeterminado para cïlulas GZM-B+ y el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) para cïlulas GZM-B+ en IM es menor que el valor de referencia IM predeterminado para cïlulas GZM-B+, entonces se determina un pronïstico de resultado pobre para dicho cïncer.

2. El procedimiento in vitro segïn la reivindicaciïn 1, en el que dicho cïncer se selecciona del grupo que consiste en cïncer adrenocortical, cïncer anal, cïncer del conducto biliar (por ejemplo, cïncer perihilar, cïncer del conducto biliar distal, cïncer del conducto biliar intrahepïtico) , cïncer de vejiga, cïncer de huesos (por ejemplo, osteoblastoma, osteocondroma, hemangioma, fibroma condromixoide, osteosarcoma, condrosarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, tumor de cïlula gigante del hueso, cordoma, mieloma mïltiple) , cïncer de cerebro y sistema nervioso central (por ejemplo, meningioma, astocitoma, oligodendrogliomas, ependimoma, gliomas, meduloblastoma, ganglioglioma, Schwannoma, germinoma, craniofaringioma) , cïncer de mama (por ejemplo, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, carcinoma lobular in situ, ginecomastia) , cïncer cervical, cïncer colorrectal, cïncer endometrial (por ejemplo, adenocarcinoma endometrial, adenocantoma, adenocarcinoma papilar seroso, cïlula clara) , cïncer de esïfago, cïncer de vesïcula biliar (adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de cïlula pequeïa) , tumores carcinoides gastrointestinales (por ejemplo, coriocarcinoma, corioadenoma destruens) , sarcoma de Kaposi, cïncer de riïïn (por ejemplo, cïncer de cïlula renal) , cïncer larïngeo e hipofarïngeo, cïncer de hïgado (por ejemplo, hemangioma, adenoma hepïtico, hiperplasia nodular focal, carcinoma hepatocelular) , cïncer de pulmïn (por ejemplo, cïncer de cïlula pequeïa de pulmïn, cïncer de cïlula no pequeïa de pulmïn) , mesotelioma, plasmacitoma, cïncer de seno de la cavidad nasal y paranasal (por ejemplo, estesioneuroblastoma, granuloma de lïnea media) , cïncer nasofarïngeo, neuroblastoma, cïncer de cavidad oral y orofarïngeo, cïncer de ovario, cïncer pancreïtico, cïncer de pene, cïncer de pituitaria, cïncer de prïstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma (por ejemplo, rabdomiosarcoma embrionario, rabdomiosarcoma alveolar, rabdomiosarcoma pleomïrpfico) , cïncer de glïndula salivar, cïncer de piel (por ejemplo, melanoma, cïncer de piel sin melanoma) , cïncer de estïmago, cïncer testicular (por ejemplo, seminoma, cïncer de cïlula germinal no seminoma) , cïncer de timo, cïncer tiroideo (por ejemplo, carcinoma folicular, carcinoma anaplïsico, carcinoma poco diferenciado, carcinoma medular tiroideo) , cïncer vaginal, cïncer vulvar, y cïncer uterino (por ejemplo, leiomiosarcoma uterino) .

3. El procedimiento in vitro segïn la reivindicaciïn 1, en el que el cïncer es cïncer colorrectal.

4. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cuantificaciïn de la densidad celular se lleva a cabo en la etapa a) por inmunodetecciïn.

5. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tiempo de supervivencia es Supervivencia libre de enfermedad (DFS) .

6. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tiempo de supervivencia es Supervivencia total (OS) .

7. Un procedimiento in vitro para el pronïstico del tiempo de supervivencia de un paciente que padece un cïncer,

en el que dicho procedimiento es mediante la mediciïn del nivel de la respuesta inmune adaptativa de dicho paciente,

en el que una respuesta inmune adaptativa fuerte se correlaciona con un pronïstico del cïncer favorable y una respuesta inmune adaptativa dïbil se correlaciona con un pronïstico pobre y

en el que el nivel de la respuesta inmune adaptativa se mide:

a) llevando a cabo una cuantificaciïn de la densidad celular de cïlulas GZM-B+ en una muestra de tejido tumoral,

b) comparando el valor de cuantificaciïn obtenido en la etapa a) con un valor de referencia predeterminado, en el que el valor de referencia predeterminado se correlaciona con tiempo de supervivencia.

8. El procedimiento in vitro segïn la reivindicaciïn 7, en el que dicho cïncer se selecciona del grupo que consiste en cïncer adrenocortical, cïncer anal, cïncer del conducto biliar (por ejemplo, cïncer perihilar, cïncer del conducto biliar distal, cïncer del conducto biliar intrahepïtico) , cïncer de vejiga, cïncer de huesos (por ejemplo, osteoblastoma, osteocondroma, hemangioma, fibroma condromixoide, osteosarcoma, condrosarcoma, fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, tumor de cïlula gigante del hueso, cordoma, mieloma mïltiple) , cïncer de cerebro y sistema nervioso central (por ejemplo, meningioma, astocitoma, oligodendrogliomas, ependimoma, gliomas, meduloblastoma, ganglioglioma, Schwannoma, germinoma, craniofaringioma) , cïncer de mama (por ejemplo, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal infiltrante, carcinoma lobular infiltrante, carcinoma lobular in situ, ginecomastia) , cïncer cervical, cïncer colorrectal, cïncer endometrial (por ejemplo, adenocarcinoma endometrial, adenocantoma, adenocarcinoma papilar seroso, cïlula clara) , cïncer de esïfago, cïncer de vesïcula biliar (adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de cïlula pequeïa) , tumores carcinoides gastrointestinales (por ejemplo, coriocarcinoma, corioadenoma destruens) , sarcoma de Kaposi, cïncer de riïïn (por ejemplo, cïncer de cïlula renal) , cïncer larïngeo e hipofarïngeo, cïncer de hïgado (por ejemplo, hemangioma, adenoma hepïtico, hiperplasia nodular focal, carcinoma hepatocelular) , cïncer de pulmïn (por ejemplo, cïncer de cïlula pequeïa de pulmïn, cïncer de cïlula no pequeïa de pulmïn) , mesotelioma, plasmacitoma, cïncer de seno de la cavidad nasal y paranasal (por ejemplo, estesioneuroblastoma, granuloma de lïnea media) , cïncer nasofarïngeo, neuroblastoma, cïncer de cavidad oral y orofarïngeo, cïncer de ovario, cïncer pancreïtico, cïncer de pene, cïncer de pituitaria, cïncer de prïstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma (por ejemplo, rabdomiosarcoma embrionario, rabdomiosarcoma alveolar, rabdomiosarcoma pleomïrpfico) , cïncer de glïndula salivar, cïncer de piel (por ejemplo, melanoma, cïncer de piel sin melanoma) , cïncer de estïmago, cïncer testicular (por ejemplo, seminoma, cïncer de cïlula germinal no seminoma) , cïncer de timo, cïncer tiroideo (por ejemplo, carcinoma folicular, carcinoma anaplïsico, carcinoma poco diferenciado, carcinoma medular tiroideo) , cïncer vaginal, cïncer vulvar, y cïncer uterino (por ejemplo, leiomiosarcoma uterino) .

9. El procedimiento in vitro segïn la reivindicaciïn 7 u 8, en el que dicha muestra de tejido tumoral se selecciona del grupo que consiste en (i) un tumor primario global (como una totalidad) , (ii) una muestra de tejido del centro del tumor, (iii) una muestra de tejido a partir del tejido que rodea directamente al tumor, pudiendo ser dicho tejido denominado mïs especïficamente “borde invasivo” del tumor, (iv) los ganglios linfïticos localizados muy cerca del tumor, (v) una biopsia del tumor recogida antes de cirugïa y (vi) una metïstasis distante.

10. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la etapa a) se lleva a cabo mediante la cuantificaciïn de, como mïnimo, dos marcadores biolïgicos distintos, respectivamente la densidad celular de cïlulas GZM-B+ y, como mïnimo, un marcador biolïgicos adicional que es la densidad celular de cïlulas seleccionadas del grupo que consiste en cïlulas CD8+, cïlulas CD3+ y cïlulas CD45RO+.

11. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la cuantificaciïn de la densidad celular se lleva a cabo en la etapa a) por inmunodetecciïn.

12. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el tiempo de supervivencia es Supervivencia libre de enfermedad (DFS) .

13. El procedimiento in vitro segïn cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el tiempo de supervivencia es Supervivencia total (OS) .