Procedimiento diagnóstico.

Un procedimiento de detección de la presencia, o seguimiento de la gravedad,

de una afección que se caracteriza por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente en el que la afección es: Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Múltiple, Demencia Frontotemporal, Esclerosis Amiotrófica Lateral, o demencia con cuerpos de Lewy, y el procedimiento comprende las etapas de: (i) proveerse de una muestra de líquido cefalorraquídeo o de sangre que se obtiene del paciente;

(ii) clasificar una pluralidad de células de la muestra y seleccionar los macrófagos activados con el fin de proporcionar una muestra enriquecida que comprende macrófagos activados; y

(iii) detectar la presencia de la proteína marcadora o fragmentos de la misma que están en los macrófagos de la muestra enriquecida y que estaban en los macrófagos del paciente, comparando los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma con un nivel de referencia, siendo el nivel de referencia un promedio de los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma que hay en los macrófagos obtenidos del líquido cefalorraquídeo o de la sangre de una pluralidad de individuos sin la afección y que estaban en los macrófagos de la pluralidad de individuos, de forma que el nivel de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma es anormal si existe una diferencia estadísticamente significativa respecto al nivel de referencia y donde los niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma en los macrófagos son indicativos de la presencia o de la gravedad de la afección en el paciente.

y en el que: la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es el péptido Ab; la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina; la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina; la afección es la Demencia Frontotemporal y la proteína marcadora es la proteína tau; la afección es la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau; o la afección es la Enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es al alfa-sinucleína.

Procedimiento diagnóstico

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia o para el seguimiento de la gravedad de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente.

Antecedente La enfermedad de Alzheimer (EA) es con mucho la enfermedad más frecuente que produce demencia, y los mecanismos de acumulación de amiloide similares a los de la EA están implicados también en las dos siguientes causas más comunes, la vascular (EVa) y la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) . La EA tiene un curso prolongado desde el momento del diagnóstico y produce un deterioro también en la salud de los cuidadores [1, 2]. En un sistema de gestión de atención médica, la EA también es una gran carga para el sistema público de salud [3], el impacto económico ya se estima mayor en ciertos casos que el del cáncer, apoplejía y enfermedad cardíaca [4, 5]. La prevalencia de la EA aumenta desde un10 % por encima de los 65 años de edad, al 50 % entre los mayores de 85 [6. 7] y puede cuadruplicarse en 2050 debido a las tasas de incidencia que aumentan exponencialmente con la edad [8] y un número mayor de ancianos [9].

Hoy día, parece que estamos a punto de obtener una terapia contra la progresión de la enfermedad de Alzheimer (EA) [10]. Lo que incrementará drásticamente la importancia de un diagnóstico precoz preciso, y cambiará el foco de las investigaciones en dirección a la comprensión del proceso de inducción de la enfermedad EA.

La caracterización de pacientes con Disfunción Cognitiva Ligera (DCL) [11] y el criterio de investigación propuesto recientemente para la EA [12] ayudan a identificar un grupo de pacientes que tienen un aumento del riesgo de tener demencia progresiva [13]. Se sabe que el inicio de la EA y la progresión están ligados a la producción de PPA (proteína precursora de amiloide) en el sistema nervioso central (SNC) ; el metabolismo de la PPA en proteína Aβ42 por la β- y γ-secretasa; y la acumulación de la proteína Aβ42 en placas de amiloide [14, 15]. A continuación se produce la agregación de tau, el mal ensamblaje de microtúbulos y la degeneración neurofibrilar [10, 16, 17], posiblemente como resultado de la interacción con la Aβ42 [18- 20]. El desarrollo de la enfermedad está fuertemente influenciado por la disposición genética [21, 22], pero probablemente también por factores epigenéticos y factores de riesgo adquiridos como la enfermedad cerebrovascular [23] y mecanismos proteómicos [24] e inmunológicos [25]. La concentración de Aβ42 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) refleja niveles parenquimáticos que aumentan con la edad por encima de los 50 [26]. Sin embargo, la concentración de Aβ42 en el LCR se reduce en pacientes que desarrollan EA [27, 28] probablemente debido a la acumulación en placas de amiloide [29].

Se desconoce la duración del periodo de tiempo desde el inicio de la EA al desarrollo de la demencia en pacientes individuales. Las pruebas de las autopsias realizadas en pacientes que han muerto por causas no relacionadas sugieren que puede haber daños iniciales limitados parecidos a los de la EA décadas antes [30], pero la evolución natural de estas lesiones se desconoce. Una fase preclínica extensa desde el inicio de la enfermedad hasta la demencia clínica nos puede dar un gran margen de tiempo para la terapia.

La demencia está precedida por una disfunción cognitiva ligera (DCL) [11, 13, 31]. En este estadio, algunos pacientes tienen un aumento del riesgo de progresión a demencia (tasa de conversión anual del 6-25 % [13]) , aunque otros pueden tener una afección que se limita a DCL durante varios años. Las pruebas del escáner indican que un subgrupo de pacientes con DCL tiene acumulación cerebral de amiloide [32, 34]. Esta prueba apoya los resultados de los estudios con marcadores del LCR, en los que se tiende a encontrar bajos niveles del precursor de amiloide Aβ42 en el LCR, relacionados con la deposición de amiloide cerebral, en subgrupos con DCL que posteriormente progresan a demencia por Alzheimer. Muchos de estos pacientes satisfacen los nuevos criterios de investigación de la EA [12]. Como se ha descrito anteriormente, la neuropsicología, la proteómica del LCR y el neuroescáner han contribuido a la comprensión de la DCL. La inducción de la enfermedad se produce más 55 temprano, y se puede solapar un periodo de latencia con el estadio DCL, de forma que la enfermedad es detectable.

Sin embargo, todavía no hay medios fiables para detectar los estadios tempranos de EA, incluso cuando estos periodos tempranos se vuelven valorables clínicamente por implementación de terapias de modificación de la enfermedad [35]. Esto es significativo porque, en estadios más tardíos, el daño generalizado causado por la EA es más probable que sea irreversible [16]. Por lo tanto, la detección temprana de EA es importante para tratarla eficazmente.

Fiala M. y col. [39] amplían esta información en un estudio en el que los monocitos (células positivas CD68) obtenidas de muestras de sangre de pacientes con EA e individuos control se diferenciaban en macrófagos y luego 65 se exponían a proteína Aβ in vitro. La proteína Aβ se conjugaba con un marcador visible y las células se examinaban por fluorescencia o microscopía confocal con el fin de determinar la ingesta de proteína Aβ. El estudio indica que los macrófagos derivados de pacientes con EA eran ineficaces en la fagocitosis de la proteína Aβ en comparación con los controles. Sin embargo, la estrategia seguida en este estudio es bastante laboriosa y no deja claro en qué estadio del desarrollo de EA se produciría un resultado positivo con esta técnica.

Otras afecciones patológicas del sistema nervioso central que se han caracterizado por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora del cerebro incluyen la Enfermedad de Parkinson, la Esclerosis Múltiple, la Demencia Frontotemporal y la Esclerosis Amiotrófica Lateral. En cada uno de estos casos es deseable el pronóstico precoz de la afección.

Por lo tanto, la presente invención busca el alivio de uno o más de los problemas anteriores y proporciona un procedimiento mejorado para detectar la presencia o para hacer el seguimiento de la gravedad de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente.

Buddenhagen y col., (1987. J Neurol, 234, 257-258) , amplían la información sobre la fagocitosis de partículas de látex por los monocitos obtenidos de pacientes con Esclerosis Múltiple. Kim y col (2006. Exp Mol Med, 38 (4) , 333347) revisan el papel de la microglía en trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple. Informa que la proteína amiloide-beta recluta e induce la actividad fagocítica de la microglía. Oe y col (2006. Rapid Comm Mass Spectr, 20, 3723-3735) amplían la información sobre técnicas para cuantificar los niveles de péptidos amiloide-beta en el líquido cefalorraquídeo. Los ensayos llevados a cabo por estos autores no determinan el nivel de proteína Aβ en los macrófagos de los pacientes.

Liu y col (2005. Brain 128, 1778-1789) amplían la información en un estudio en el que se observó que la Aβ42 exógena era fagocitada por las células de la microglía de una manera dependiente de CD14. El estudio se llevó a cabo analizando las células de la microglía cultivadas in vitro y luego tratando las células con fAβ42 biotinilada. Este estudio también incluye el análisis inmunohistoquímico del tejido cerebral de pacientes que padecían enfermedad de Alzheimer y sujetos control. Jung y col (1999. Neurobiol, 20, 249-257) amplían la información sobre la inmunorreactividad de la superficie celular a AβPP en la circulación periférica o en monocitos sanguíneos.

Sumario de la Invención De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia o para el seguimiento de la gravedad, de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de un marcador en el cerebro de un paciente que comprende las etapas de:

(i) proveerse una muestra de sangre o líquido cefalorraquídeo que se obtiene del paciente en que la muestra comprende macrófagos activados;

(ii) clasificar una pluralidad de células en la muestra y seleccionar los macrófagos activados con el fin de 40 proporcionar una muestra enriquecida que comprenda los macrófagos activados; y

(iii) detectar la presencia de la proteína marcadora o fragmentos de la misma que están en los macrófagos de la muestra enriquecida... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de la presencia, o seguimiento de la gravedad, de una afección que se caracteriza por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente en el que la afección es: Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Múltiple, Demencia Frontotemporal, Esclerosis Amiotrófica Lateral, o demencia con cuerpos de Lewy, y el procedimiento comprende las etapas de:

(i) proveerse de una muestra de líquido cefalorraquídeo o de sangre que se obtiene del paciente;

(ii) clasificar una pluralidad de células de la muestra y seleccionar los macrófagos activados con el fin de proporcionar una muestra enriquecida que comprende macrófagos activados; y

(iii) detectar la presencia de la proteína marcadora o fragmentos de la misma que están en los macrófagos de la muestra enriquecida y que estaban en los macrófagos del paciente, comparando los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma con un nivel de referencia, siendo el nivel de referencia un promedio de los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma que hay en los macrófagos obtenidos del líquido cefalorraquídeo o de la sangre de una pluralidad de individuos sin la afección y que estaban en los macrófagos de la pluralidad de individuos, de forma que el nivel de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma es anormal si existe una diferencia estadísticamente significativa respecto al nivel de referencia y donde los niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma en los macrófagos son indicativos de la presencia o de la gravedad de la afección en el paciente.

y en el que: la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es el péptido Aβ; la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina; la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina; la afección es la Demencia Frontotemporal y la proteína marcadora es la proteína tau; la afección es la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau; o la afección es la Enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es al alfa-sinucleína.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma es una reducción de los niveles en comparación con el nivel de referencia, un aumento de los niveles en comparación con el nivel de referencia o la ausencia de proteína marcadora y/o de fragmentos de la misma.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la presencia de niveles anormales de la proteína

marcadora y/o de los fragmentos de la misma es la presencia de un patrón anormal de los fragmentos de la proteína marcadora.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la etapa de clasificación comprende el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia o de extracción magnética.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (iii) comprende la lísis de los macrófagos y la inmunoprecipitación de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (iii) comprende la detección de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma utilizando espectrometría de masas, preferentemente espectrometría de masas de ionización/desorción mediante láser asistida por una matriz con analizador de tiempo de vuelo.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (iii) comprende la detección de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma utilizando HPLC-fluorescencia, HPLC-UV, luminiscencia o sistemas de estreptavidina/biotina.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la

etapa de detección de al menos un marcador adicional de la afección, en el que la presencia de dicho marcador adicional y/o la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma en los macrófagos es indicativo de la presencia de la afección en el paciente.

9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína es el péptido Aβ y en el que el péptido Aβ comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 1.

10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina y en el que la secuencia de la proteína ubiquitina comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 2.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina y en el que la secuencia de la proteína básica de mielina comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC

ID Nº 3.

12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la afección es la Demencia Frontotemporal o la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau y en el que la secuencia de la proteína tau comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70

%, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 4.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la afección es la Enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy o Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es la proteína alfa-sinucleína y en el que la secuencia de la proteína alfa-sinucleína comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 5.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que utiliza un kit que comprende:

un reactivo de unión específico de diana capaz de unirse a la proteína marcadora; y

un reactivo de unión específico de macrófagos capaz de unirse específicamente a un macrófago, y en el que el kit se utiliza sobre la muestra obtenida del paciente.