Procedimiento de prevención o tratamiento de infección por M. tuberculosis.

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 4.

Procedimiento de prevención o tratamiento de infección por M. tuberculosis Campo de la invención La presente invención se refiere a proteínas de fusión M72 y aspectos relacionados.

Antecedentes de la invención La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por la infección con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad principal en los países en desarrollo, así como un problema creciente en las áreas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un período de tiempo considerable, la enfermedad se manifiesta más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, dando como resultado fiebre y una tos no productora. Si no se trata, resultan típicamente complicaciones graves y la muerte.

Aunque la tuberculosis se puede controlar en general empleando terapia prolongada con antibióticos, este tratamiento no es suficiente para evitar la propagación de la enfermedad. Los individuos infectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. Además, aunque es crítico el cumplimiento con el régimen de tratamiento, es difícil monitorear el comportamiento del paciente. Algunos pacientes no terminan el periodo de tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento inefectivo y al desarrollo de resistencia a los fármacos. Inclusive cuando se ha terminado un curso completo de tratamiento, la infección con M. tuberculosis no se erradica del individuo infectado, sino que permanece como una infección latente que se puede reactivar.

Con el objeto de controlar la propagación de la tuberculosis, es de primordial importancia una vacunación efectiva y un diagnóstico precoz preciso de la enfermedad. En la actualidad, la vacunación con bacterias vivas es el procedimiento más eficiente para inducir una inmunidad protectora. La micobacteria más común empleada para este propósito es Bacillus Calmette-Guerin (BCG) , una cepa avirulenta de M. bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia de BCG es una fuente de controversia y algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público en general con este agente.

El diagnóstico de la tuberculosis se logra comúnmente utilizando una prueba de piel, la que involucra la exposición intradérmica a la tuberculina PPD (derivado purificado de proteína) . Las respuestas de las células-T específicas del antígeno dan como resultado una induración mensurable en el sitio de inyección a las 48-72 horas después de la inyección, lo que indica la exposición a los antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad han sido un problema con esta prueba y los individuos vacunados con BCG no se pueden distinguir de los individuos infectados.

Aunque se ha demostrado que los macrófagos actúan como los efectores principales de la inmunidad a Mycobacterium, las células-T son los inductores predominantes de esta inmunidad. El papel esencial de las células-T en la protección contra la infección por Mycobacterium se ilustra por la frecuente aparición de infección por Mycobacterium en los pacientes de SIDA, debido al agotamiento de las células-T CD4+ asociado con la infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . Se ha demostrado que las células-T CD4+ que reaccionan con Mycobacterium son potentes productores del interferón- (IFN-) , que, a su vez, se ha demostrado que desencadena los efectos anti-micobacterianos de los macrófagos en los ratones. Aunque está menos claro el papel del IFN- en los seres humanos, los estudios han demostrado que la 1, 25-dihidroxi-vitamina D3, ya sea sola o en combinación con IFN- o con el factor de necrosis tumoral-alfa, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Adicionalmente, se sabe que el IFN- estimula los macrófagos humanos para hacer la 1, 25-dihidroxivitamina D3. De una manera similar, se ha demostrado que la interleucina-12 (IL-12) tiene un papel en el estímulo de la resistencia a la infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección por M. tuberculosis, véase Chan y Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom, editor, 1994) , Tuberculosis (2ª edición, Rom y Garay, editores, 2003) y Harrison's Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16ª edición, Braunwald y colaboradores, editores, 2005) .

Los documentos WO03/070187 y WO01/98460 describen proteínas de fusión de Mycobacterium tuberculosis.

El documento WO03/072792 describe construcciones de proteínas de fusión heterólogas que comprenden un antígeno de leishmania.

Descripción de las secuencias enumeradas SEC ID Nº :1: Mtb72f con etiqueta 6 His N-terminal (ADN) .

SEC ID Nº :2: Mtb72f con etiqueta 6 His N-terminal (proteína) .

SEC ID Nº :3: M72 (variante de Mtb72f) con inserción de 2 His N-terminal (ADN) .

SEC ID Nº :4: M72 (variante de Mtb72f) con inserción de 2 His N-terminal (proteína) .

SEC ID Nº :5: Mtb72f sin inserción de His N-terminal (ADN) .

SEC ID Nº :6: Mtb72f sin inserción de His N-terminal (proteína) .

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 4, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 4 y composiciones farmacéuticas relacionadas.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra una representación gráfica del modelo de reactivación de M. tuberculosis en ratones Swiss Webster (SWR/J) . La figura muestra los puntos del tiempo para la infección, el tratamiento con quimioterapia (50 miligramos de rifampina/85 miligramos de isoniazida por litro del agua para beber) , las inmunizaciones y la enumeración de la carga bacteriana/las unidades formadoras de colonias (CFU) .

La Figura 2 muestra las respuestas inmunes de los anticuerpos IgG1 e IgG2a en ratones SWR/J infectados con M. tuberculosis tratados con quimioterapia y luego inmunizados con Mtb72f. Los ratones se dejaron sin tratamiento, se trataron con quimioterapia (50 miligramos de rifampina/85 miligramos de isoniazida por litro del agua potable) , o bien se trataron con quimioterapia y se inmunizaron tres veces intramuscularmente con 8 microgramos por dosis de Mtb72f formulada sin adyuvante. 10 días después de la última inmunización, los ratones se sangraron y se probaron los sueros para determinar la respuesta del anticuerpo anti-Mtb72f para ambos isótopos IgG1 (rojo) e IgG2a (negro) mediante ELISA.

La Figura 3 muestra las respuestas inmunes de los anticuerpos IgG1 e IgG2a en los ratones SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados con quimioterapia y luego inmunizados con Mtb72f. Los ratones se dejaron sin tratamiento, se trataron con quimioterapia (50 miligramos de rifampina/85 miligramos de isoniazida por litro del agua potable) , o se trataron con quimioterapia y se inmunizaron tres veces intramuscularmente con 8 microgramos por dosis de Mtb72f formulada con el adyuvante AS01B. 10 días después de la última inmunización, los ratones se sangraron y se probaron los sueros para determinar la respuesta del anticuerpo anti-Mtb72f para ambos isótopos IgG1 (rojo) e IgG2a (negro) mediante ELISA.

La Figura 4 muestra las respuestas del interferón-gamma (IFN-) en los ratones SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados con quimioterapia y luego inmunizados con Mtb72f. Se obtuvieron células de bazo de los ratones en diferentes puntos del tiempo y se estimularon in vitro durante 3 días con 10 microgramos/mililitro ya sea de rMtb72f o bien de los componentes (Mtb32C y Mtb39) , como se indica. Como controles, también se estimularon cultivos de esplenocitos ya sea con PPD (3 microgramos/mililitro) , lisado de BCG (10 microgramos/mililitro) , conA (3 microgramos/mililitro) , o el medio solo. Subsiguientemente se midió la producción de IFN- mediante ELISA.

La Figura 5 muestra las respuestas de IFN- en los ratones SWR/J infectados por M. tuberculosis tratados con quimioterapia y luego inmunizados con Mtb72f. Se obtuvieron células de bazo de los ratones en diferentes puntos del tiempo y se estimularon in vitro durante 3 días con 10 microgramos/mililitro ya sea de rMtb72f, o bien de los componentes (Mtb32C y Mtb39) , como se indica. Como los controles, también se estimularon cultivos de esplenocitos ya sea con PPD (3 microgramos/mililitro) , lisado de BCG (110 microgramos/mililitro) , conA (3 microgramos/mililitro) , o el medio solo. Subsiguientemente se midió la producción de IFN- mediante ELISA.

La Figura 6 muestra las respuestas... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 4. 2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 4. 3. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos

de SEC ID Nº : 4.

4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº : 3. 5. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1. 6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende adicionalment.

3. MPL y QS21

en una formulación de liposomas .

3. MPL y QS21 en una emulsión de aceite en agua.

7. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el polinucleótido se proporciona en un vector viral.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el polinucleótido se proporciona en 15 una célula huésped bacteriana.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la bacteria es Bacillus Calmette-Guerin.