Procedimiento de preparación de un concentrado de von Willebrand (fvw) mediante cromatografía y concentrado de fvw susceptible de ser así obtenido.

Concentrado de factor de von Willebrand de uso terapéutico que se puede obtener por aplicación de un procedimiento a partir de una fracción biológica de plasma que contiene factor de von Willebrand,

que comprende una separación por cromatografía de intercambio de aniones en un soporte de polímero vinílico, de tipo base débil, y que comprende las etapas de

a) carga de dicho soporte cromatográfico, previamente equilibrado con un tampón adecuado, con una fracción biológica que contiene factor de von Willebrand, a un caudal predeterminado, lo que permite la retención del factor de von Willebrand

b) lavado de dicho soporte cromatográfico con un tampón ácido a un caudal superior al de la etapa a) hasta eliminar las proteínas y los contaminantes no retenidos;

c) enjuague y equilibrado del soporte cromatográfico con el tampón y el caudal de la etapa a); y

d) elución del factor de von Willebrand mediante el aumento de la fuerza iónica del tampón de la etapa c), caracterizado porque la relación Factor VIII:C/FvW:RCo es inferior a 0,06% y porque la tasa de multímeros de factor de von Willebrand es comparable a la del plasma original.

Procedimiento de preparación de un concentrado de von Willebrand (FvW) mediante cromatografía y concentrado de FvW susceptible de ser así obtenido La presente solicitud se refiere a un procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand (FvW) mediante cromatografía y a un concentrado de FvW susceptible de ser así obtenido 5

El factor de von Willebrand es una proteína sanguínea multimérica cuyo peso molecular se sitúa entre aproximadamente 200 kDa y alrededor de 20 000 kDa, o incluso más. Esta proteína, sintetizada por las plaquetas y las células endoteliales, desempeña un papel fundamental en la lucha contra la hemorragia sanguínea, ya que el FvW actúa como un tampón gelificable que se extiende sobre una brecha vascular proporcionando adhesión de plaquetas para lograr la primera fase de la hemostasia, es decir, la formación del "tapón plaquetario" (trombo) . Alrededor de este 10 trombo se van a organizar los fenómenos de coagulación destinados a consolidar la detención del sangrado por formación de un coágulo de fibrina insoluble. El FvW también garantiza la estabilización y el transporte del Factor VIII en la circulación sanguínea, con el que está asociado en forma de complejos de tamaños variables, que se encuentra así protegido contra una rápida degradación mediante proteólisis debido a la sensibilidad del Factor VIII aislado frente a las proteasas. 15

Una deficiencia congénita en el FvW o mutaciones genéticas que modifiquen las propiedades del FvW conlleva la enfermedad de Willebrand, que se manifiesta, por lo tanto, por perturbaciones en la hemostasia primaria y en la coagulación.

Es esencial, por tanto, para el tratamiento de esta enfermedad, disponer de derivados de plasma humano enriquecidos en FvW de elevada pureza compatibles con inyecciones múltiples y repetidas. En efecto, las muestras de FvW 20 insuficientemente purificadas procedentes del fraccionamiento del plasma humano contienen diferentes contaminantes (proteínas residuales) que pueden inducir respuestas inmunológicas adversas. Además, la administración de factor de von Willebrand asociado al factor VIII puede conllevar un riesgo de trombosis o de hipercoagulabilidad para el paciente tratado (Makris y col., Thromb. Haemost, 88, 2002, pp. 377-378, Manucci P.M., Thromb.Haemost, 88, 2002, pp. 378-379) . 25

Diversos procedimientos de preparación de concentrados de FvW asocian típicamente etapas de precipitación de una fracción de plasma, destinadas a eliminar la mayor parte de las proteínas indeseables (fibrinógeno, fibronectina, etc.) , y/o cromatográficas (intercambio iónico, de afinidad, de inmunoafinidad, de exclusión por tamaños, etc.) destinadas a la obtención de concentrados de gran pureza, que tengan una actividad específica elevada, y que permiten conservar la integridad de las formas multiméricas, especialmente las de elevado peso molecular cuya importancia biológica es 30 fundamental en los procesos de cicatrización.

A modo de ejemplo, se puede citar la patente EP 0 359 593 que divulga la separación de proteínas de una fracción de plasma crioprecipitado que utiliza varias etapas de cromatografía de intercambio de aniones conducentes a la purificación del FvW.

La patente EP 0 503 991 divulga un procedimiento de preparación a la escala industrial de un concentrado de FvW que 35 comprende una etapa de prepurificación de una fracción crioprecipitada de plasma y tres etapas sucesivas de cromatografía, siendo la tercera una cromatografía de afinidad en columna de gelatina inmovilizada sobre agarosa. El concentrado de FvW así obtenido muestra una actividad específica superior a 100 UI RCo/mg expresada en unidades de actividad del cofactor de ristocetina por mg de proteína y un índice de multímeros de alto peso molecular comparable al del plasma inicial. 40

La solicitud de patente EP 0 934 748 describe un procedimiento de preparación del FvW que incluye la combinación de cromatografías de intercambio de aniones y de intercambio de cationes. Las fracciones de FvW obtenidas presentan una actividad específica superior a 100 UI de FvW:Ag/mg expresada en unidades de antígeno de FvW por mg de proteína, pero que contienen proporciones más notables de factor VIII.

La patente US 6 579 723 describe un procedimiento de preparación de un FvW muy purificado mediante cromatografía 45 de inmunoafinidad cuyos inmunoadsorbentes representan anticuerpos dirigidos contra FvW. Se puede preferir igualmente una etapa de purificación adicional mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sin embargo, el inconveniente de una purificación por inmunoafinidad es la posible presencia de anticuerpos residuales que puedan provocar reacciones inmunológicas.

La patente EP 0 383 234 enseña la preparación de un concentrado de FvW pasteurizado mediante cromatografía de 50 intercambio de aniones, que se utiliza con disoluciones ácidas (pH de 5, 5 a 6, 5) que contienen hidratos de carbono, para fijar el factor VIII en el intercambiador de aniones. La recuperación conjunta de FvW, fibronectina y fibrinógeno no retenidos, mediante lavado del soporte, requiere etapas de precipitación adicionales para aislar un concentrado de FvW purificado.

Los autores del documento Josic D y col.: 1 de enero de 1994 (01-01-1994) , en 1994, así como los autores de los 55 documentos US 5.408.039 y EP 0.503.991, en 1992, ya intentaron purificar el factor de von Willebrand. De este modo, el procedimiento aplicado en Josic D y col., 1 de enero de 1994 (01-01-1994) , no permite obtener un factor de von Willebrand con una pureza satisfactoria. En lo que respecta al procedimiento aplicado en los documentos US 5.408.039 (o EP 0.503.991) , los solicitantes han conseguido obtener un factor de von Willebrand con una actividad específica de 205 U Ag/mg proteína o de 345 U CBA/mg de proteína, que corresponde a un grado total de purificación, con respecto al plasma inicial, superior a 10000 veces. De este modo, el grado de pureza del factor de von Willebrand 5 no proporciona ninguna indicación en lo que respecta a la presencia o ausencia del Factor VI II:C en el concentrado de factor de von Willebrand obtenido al finalizar la purificación.

Los procedimientos descritos anteriormente presentan el inconveniente de requerir varias etapas sucesivas, especialmente cromatográficas, lo que supone problemas de rendimiento y lentitud de aplicación a escala industrial. Pueden utilizar, según los casos, soportes cromatográficas con ligandos de origen animal, tales como a base de 10 gelatina, heparina o colágeno susceptibles de ser vehículo del prion patógeno responsable de la encefalopatía espongiforme u otros virus específicos de la especie animal considerada. Estas dificultades aumentan debido a la necesidad de incluir en el procedimiento una inactivación viral y, en su caso, etapas adicionales de eliminación de agentes virucidas. Además, los concentrados de FvW obtenidos por dichos procedimientos no están exentos de factor VIII, lo que presenta el inconveniente de riesgos de trombosis en los pacientes. Además, la limpieza o lavado de los 15 soportes de afinidad así como su desinfección sigue siendo difícil debido a la fragilidad del ligando, que impide el uso de disoluciones limpiadoras de propiedades desinfectantes fuertes (lejía, sosa cáustica, potasa cáustica, etc.) . Finalmente, los soportes de afinidad tienen duraciones bastante cortas y su sustitución frecuente representa una importante carga financiera que aumenta el precio de coste del producto tratado.

Teniendo en cuenta las crecientes necesidades de fracciones de FvW muy puras, el solicitante se ha propuesto poner 20 a punto un procedimiento para la preparación de FvW, cuya aplicación es muy simple, de alto rendimiento, que no requiere el uso de soportes cromatográficos con ligandos de origen animal y que da lugar a un concentrado de FvW de gran pureza, normalizado, con una actividad específica muy elevada y exento de factor VIII.

La invención se refiere a:

1. Un concentrado de factor de von Willebrand de uso terapéutico que se puede obtener por aplicación de un 25 procedimiento a partir de una fracción biológica de plasma que contiene factor de von Willebrand, que comprende una separación por cromatografía de intercambio de aniones con un soporte de polímero vinílico, de tipo base débil, incluyendo dicha separación las etapas de a) carga del soporte cromatográfico previamente equilibrado con un tampón adecuado con una fracción biológica que contiene factor de von Willebrand, a un caudal predeterminado, lo que permite la retención del 30 factor de von Willebrand b) lavado de dicho soporte cromatográfico con un tampón ácido con un caudal superior al de la etapa a) hasta eliminar las proteínas... [Seguir leyendo]

1. Concentrado de factor de von Willebrand de uso terapéutico que se puede obtener por aplicación de un procedimiento a partir de una fracción biológica de plasma que contiene factor de von Willebrand, que comprende una separación por cromatografía de intercambio de aniones en un soporte de polímero vinílico, de tipo base débil, y que comprende las etapas de 5

a) carga de dicho soporte cromatográfico, previamente equilibrado con un tampón adecuado, con una fracción biológica que contiene factor de von Willebrand, a un caudal predeterminado, lo que permite la retención del factor de von Willebrand b) lavado de dicho soporte cromatográfico con un tampón ácido a un caudal superior al de la etapa a) hasta eliminar las proteínas y los contaminantes no retenidos; 10

c) enjuague y equilibrado del soporte cromatográfico con el tampón y el caudal de la etapa a) ; y d) elución del factor de von Willebrand mediante el aumento de la fuerza iónica del tampón de la etapa c) , caracterizado porque la relación Factor VIII:C/FvW:RCo es inferior a 0, 06% y porque la tasa de multímeros de factor de von Willebrand es comparable a la del plasma original.

2. Concentrado de factor de von Willebrand de acuerdo con la reivindicación 1, que se puede obtener por aplicación de 15 un procedimiento en el que la separación cromatográfica se lleva a cabo en un soporte de tipo polímero vinílico injertado con grupos intercambiadores de aniones que representan DEAE, preferentemente un copolímero de oligoetilenglicol, metacrilato de glicodilo y dimecrilato de pentaeritritol.

3. Concentrado de factor de von Willebrand de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, que se puede obtener por aplicación de un procedimiento en el que el tampón de equilibrado de la etapa a) o c) está compuesto por cloruro 20 de sodio, preferentemente a una concentración de 0, 11 M.

4. Concentrado de factor de von Willebrand de acuerdo con la reivindicación 3, que se puede obtener por aplicación de un procedimiento en el que el tampón de equilibrado comprende además citrato trisódico, cloruro de calcio, glicina y lisina, preferentemente a una concentración respectiva de 0, 01 M, 0, 001 M, 0, 12 M y 0, 016 M, y en el que el pH de dicho tampón de equilibrado está comprendido entre 6, 9 y 7, 1. 25

5. Concentrado de factor de von Willebrand según una de las reivindicaciones 1 a 4, que se puede obtener por aplicación de un procedimiento en el que el tampón ácido de lavado está compuesto de una sal alcalina o alcalinotérrea de ácido acético, cítrico o fosfórico, en una concentración comprendida entre 10 y 30 mM y un pH comprendido entre 3, 9 y 5, 2.

6. Concentrado de factor de von Willebrand según una de las reivindicaciones 1 a 4, que se puede obtener por 30 aplicación de un procedimiento en el que el caudal en la etapa de lavado b) corresponde a un valor superior al de la etapa de equilibrado a) en un factor de aproximadamente 1, 5 a 2.

7. Concentrado de factor de von Willebrand según una de las reivindicaciones 1 a 4, que se puede obtener por aplicación de un procedimiento en el que, en la etapa d) , la fuerza iónica del tampón de la etapa c) está aumentada por adición de cloruro de sodio cuya concentración final se lleva a 0, 15-0, 17 M. 35

8. Concentrado de factor de von Willebrand según una de las reivindicaciones 1 a 4, que se puede obtener por aplicación de un procedimiento que comprende una etapa adicional de inactivación vírica de la fracción biológica mediante disolvente/detergente, y/o, después de la etapa de elución d) , una o varias etapas adicionales de - filtración esterilizante, - filtración de eliminación vírica, 40

- diafiltración, - ultrafiltración de concentración, - adición de un estabilizante farmacéuticamente aceptable, - liofilización, - calentamiento en seco de inactivación vírica y, 45

- reconstitución del liofilizado caliente en un medio acuoso compatible para uso clínico.

9. Concentrado de factor de von Willebrand según una de las reivindicaciones 1 a 8, que se puede obtener por aplicación de un procedimiento en el que dicha fracción biológica es una fracción biológica de plasma, preferentemente una fracción biológica de plasma combinado.

10. Concentrado de factor de von Willebrand o concentrado de factor de von Willebrand según una de las 50 reivindicaciones 1 a 9, que muestra una actividad específica de al menos 90 UI de RCo/mg de proteína.

11. Concentrado de factor de von Willebrand o concentrado de factor de von Willebrand según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el contenido en fibronectina residual es inferior a 0, 04μg/UI de FvW:R.