Polipéptidos lovd variantes y sus usos.

Polipéptido LovD variante que tiene al menos dos veces mayor actividad catalítica que la aciltransferasa de A.

terreus de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido LovD variante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que incluye las dos mutaciones siguientes: L174F y A178L, y opcionalmente de aproximadamente 1 a 30 mutaciones adicionales y opcionalmente de aproximadamente 1 a 20 mutaciones conservadoras adicionales.

Polipéptidos LovD variantes y sus usos.

1. ANTECEDENTES 5

La simvastatina es un análogo semisintético del policétido fúngico natural lovastatina que puede aislarse del caldo de fermentación de Aspergillus terreus. La simvastatina y la lovastatina son comercializadas por Merck Co. como fármacos reductores del colesterol que reducen el riesgo de enfermedad cardíaca: la simvastatina como ZOCOR® y la lovastatina como MEVACOR®. 10

La lovastatina (ilustrada en la figura 1) es un potente inhibidor de la hidroximetilglutaril coenzima A reductasa, la enzima que limita la velocidad en la ruta de biosíntesis del colesterol (Xie et al., 2006, Chemistr y & Biology 13:1161-1169) . El análogo simvastatina (también ilustrado en la figura 1) es más eficaz en el tratamiento de la hipercolesterolemia (Manzoni y Rollini, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:555-564; Istan y Diesenhofer, 2001, 15 Science 292:1160-1164) . La sustitución de la cadena lateral α-metilbutirato de la lovastatina con la cadena lateral α-dimetilbutirato que se encuentra en la simvastatina aumenta significativamente sus propiedades inhibidoras al tiempo que reduce los efectos secundarios no deseados (Klotz, Ulrich, 2003, Arzneimittel-Forschung 53: 605-611) .

Dada la importancia clínica de la simvastatina, se han descrito diversas síntesis en varias etapas partiendo 20 de la lovastatina (véase, por ejemplo, el documento WO 2005/066150, la solicitud de EE.UU. Nº 2005/0080275, la solicitud de EE.UU. Nº 2004/0068123; la patente de EE.UU. Nº 6.833.461; el documento WO 2005/040107; Hoffman et al., 1986, J. Med. Chem. 29:849-852; Schimmel et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:1307-1311) .

El clúster génico para la biosíntesis de lovastatina se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, la 25 patente de EE.UU. Nº 6.391.583; Kennedy et al., 1999, Science 284:1368-1372; Hutchinson et al., 2000, Antonie Van Leeuwenhoek 78:287-295) . Codificada en este clúster génico se encuentra la enzima de 46 kD LovD, que cataliza la última etapa de la biosíntesis de la lovastatina.

En resumen, los restos HMG-CoA y núcleo de la decalina que imitan porciones del compuesto lovastatina 30 son sintetizados in vivo por la lovastatina nonacétido sintasa (LNKS) y tres enzimas accesorias. La cadena lateral 2-metilbutirato de la lovastatina es sintetizada in vivo por la lovastatina dicétido sintasa (LDKS) y fijada covalentemente al dominio transportador de acilo de LovF mediante un enlace tioéster. La LovD, una aciltransferasa, es entonces capaz de transferir selectivamente el grupo 2-metilbutirato de LDKS al grupo hidroxilo C8 de la monacolina J en una sola etapa para producir lovastatina (Xie et al., 2006, Chemistr y & Biology 13: 1161-1169) . 35

Recientemente se ha descubierto que la aciltransferasa LovD tiene una amplia especificidad de sustrato hacia el transportador de acilo, el sustrato acilo y el aceptor de acilo decalina (Xie et al., 2006, Chem. Biol. 13:1161-1169) . Por ejemplo, LovD puede catalizar de manera eficaz la transferencia de acilo desde tioésteres de CoA o tioésteres de N-acetilcisteamina ("SNAC") hasta la monacolina J (id.) . Significativamente, cuando se utilizó 40 α-dimetilbutiril-SNAC como donador de acilo, la LovD era capaz de convertir la monacolina J y la 6-hidroxi-6-desmetil monacolina J en simvastatina y huvastatina, respectivamente (id.) . Mediante una cepa de E. coli obtenida por ingeniería genética para que sobreexpresara LovD como biocatalizador de célula completa, se sintetizaron cantidades preparativas de simvastatina en una sola etapa de fermentación (id.) .

Los estudios anteriores demuestran que la aciltransferasa LovD es una enzima atractiva para la biosíntesis de fármacos reductores del colesterol farmacéuticamente importantes tales como la simvastatina. Sin embargo, en posteriores experimentos llevados a cabo con la enzima LovD aislada, la estabilidad y la velocidad de reacción resultaron problemáticas (Xie y Tang, 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:2054-2060) . Concretamente, se descubrió que LovD precipita fácilmente (horas) a altas concentraciones de proteína (~ 100 μM) y lentamente (días) a 50 concentraciones más bajas (~ 10 μM) (id.) . Además, se descubrió que el tan deseado producto, la simvastatina, compite por la enzima LovD, impidiendo significativamente la velocidad de acilación neta global (id.) .

La enzima LovD también es muy propensa al plegamiento anómalo y a los agregados cuando se sobreexpresa en E. coli, haciendo que incluso los sistemas de biocatálisis de célula completa no sean tan ideales 55 para la producción comercial (Xie et al., 2009, Biotech. Bio. Eng. 102:20-28) .

En un esfuerzo por aumentar la solubilidad de LovD sin pérdida de actividad catalítica, se han estudiado mutantes de LovD de A. terreus de tipo silvestre. La sustitución de los residuos de cisteína en las posiciones 40 y 60 (Cys40 y Cys60) con residuos de alanina produjo mejoras tanto en la solubilidad de la enzima como en la actividad 60 biocatalítica de célula completa (id.) . Experimentos adicionales de mutagénesis que convertían estos dos residuos en aminoácidos pequeños o polares demostraron que las mutaciones Cys40 â Ala ("C40A") y Cys60 â Asn ("C60N") son las más beneficiosas, produciendo aumentos de un 27% y un 26%, respectivamente, en la actividad biocatalítica de célula completa (id.) . Cuando se combinan, estas mutaciones resultaron ser aditivas, presentando el doble mutante C40A/C60N aumentos de aproximadamente un 50% tanto en la solubilidad como en la actividad 65 biocatalítica de célula completa.

A pesar de sus propiedades mejoradas, estos mutantes de LovD no son adecuados para la producción de simvastatina a gran escala en sistemas libres de células. Resultarían deseables variantes o mutantes adicionales de enzimas LovD de A. terreus de tipo silvestre que presentasen propiedades mejoradas en comparación con el tipo silvestre y/o los mutantes conocidos .

2. RESUMEN

La invención proporciona un polipéptido LovD variante que tiene al menos dos veces mayor actividad catalítica que la aciltransferasa de A. terreus de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido LovD variante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que incluye las dos siguientes mutaciones: 10 L174F y A178L, y opcionalmente de aproximadamente 1 a 30 mutaciones adicionales y opcionalmente de aproximadamente 1 a 20 mutaciones conservadoras adicionales.

La invención también proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido LovD variante según la invención que es opcionalmente un vector de expresión adecuado para expresar el polipéptido LovD variante en una 15 célula hospedadora, y vector de expresión en el que la secuencia codificante utiliza opcionalmente codones optimizados para la expresión en la célula hospedadora.

La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido LovD variante según la invención. 20

La invención también proporciona un método de fabricación de un polipéptido LovD variante que comprende cultivar una célula hospedadora según la invención en condiciones en las que se expresa el polipéptido LovD variante y opcionalmente recuperar el polipéptido LovD variante.

La invención también proporciona un método de fabricación de simvastatina que comprende poner en contacto un sustrato monacolina J con un polipéptido LovD variante según la invención en presencia de un cosustrato tioéster de α-dimetilbutirilo y en condiciones en las que la monacolina J se convierte en simvastatina.

La invención también proporciona un método de fabricación de simvastatina que comprende poner en 30 contacto un sustrato lovastatina con un polipéptido LovD variante según la invención en presencia de un cosustrato tioéster de α-dimetilbutirilo y en condiciones en las que el sustrato lovastatina se convierte en simvastatina.

Como se ha analizado anteriormente, el gen LovD de A. terreus codifica una aciltransferasa (en lo sucesivo denominada "polipéptido LovD", "enzima LovD", "aciltransferasa LovD" o "LovD") capaz de convertir la monacolina J, 35 el producto de hidrólisis del producto natural lovastatina, en simvastatina. Los inventores de la presente descripción han descubierto que los polipéptidos LovD que incluyen mutaciones en determinadas posiciones de residuos presentan propiedades mejoradas en comparación con el polipéptido LovD de tipo silvestre producido por A. terreus (SEQ ID NO: 2) .

Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos LovD variantes que tienen una o más propiedades mejoradas en comparación... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido LovD variante que tiene al menos dos veces mayor actividad catalítica que la aciltransferasa de A. terreus de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido LovD variante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que incluye las dos mutaciones siguientes: L174F y A178L, y opcionalmente de 5 aproximadamente 1 a 30 mutaciones adicionales y opcionalmente de aproximadamente 1 a 20 mutaciones conservadoras adicionales.

2. Polipéptido LovD variante según la reivindicación 1, que tiene al menos 10 veces mayor actividad catalítica que la aciltransferasa de A. terreus de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2. 10

3. Polipéptido LovD variante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que incluye una o más de las siguientes características:

(i) una o más mutaciones que se correlacionan con una mayor actividad catalítica; 15

(ii) una o más mutaciones que se correlacionan con una mayor estabilidad térmica;

(iii) una o más mutaciones que se correlacionan con una menor agregación;

(iv) una o más mutaciones que se correlacionan con una mayor estabilidad enzimática; y (v) una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en I4N, A9V, K26E, R28K, R28S, I35L, C40A, C40V, C40F, S41R, N43Y, C60F, C60Y, C60N, C60H, S109C, S142N, A184T, A184V, N191S, A261T, A261E, 20 A261V, L292R, Q297E, L335M, A377V, A383V, N391D y H404R, y que contiene opcionalmente de aproximadamente 1 a 20 mutaciones conservadoras adicionales.

4. Polipéptido LovD variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que incluye una o más de las siguientes características: 25

(i) al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en A123P, M157V, S164G, S172N, N191G, L192I, A247S, R250K, S256T, A261H, G275S, Q297G, L361M, V370I y N391S;

(ii) al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en Q241 M, A261H, Q295R y Q412R;

(iii) al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en N43R, D96R y H404K; 30

(iv) al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en C40R, C60R y D245E; y (v) al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en I4N, A9V, K26E, R28K, R28S, I35L, C40A, C40V, C40F, S41R, N43Y, C60F, C60Y, C60N, C60H, S109C, S142N, A184T, A184V, N191S, A261T, A261E, A261V, L292R, Q297E, L335M, A377V, A383V, N391D y H404R;

y opcionalmente de aproximadamente 1 a 20 mutaciones conservadoras adicionales. 35

5. Polipéptido LovD variante según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO: 2 que incluye las siguientes mutaciones: A123P, N191 (S o G) , A247S y L361M, de cero a aproximadamente 26 mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en Q241M, A261H, Q295R, Q412R, N43R, D96R, H404K, C40R, C60R, D254E, I4N, A9V, K26E, R28K, R28S, I35L, C40A, C40V, 40 C40F, S41R, N43Y, C60F, C60Y, C60N, C60H, S109C, S142N, A184T, A184V, N191S, A261T, A261E, A261V, L292R, Q297E, L335M, A377V, A383V, N391D y H404R, y opcionalmente de aproximadamente 1 a 20 mutaciones conservadoras adicionales.

6. Polipéptido LovD variante según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada 45 de la Tabla 1.

7. Polinucleótido que codifica un polipéptido LovD variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es opcionalmente un vector de expresión adecuado para expresar el polipéptido LovD variante en una célula hospedadora, y vector de expresión en el que la secuencia codificante utiliza opcionalmente codones optimizados 50 para la expresión en la célula hospedadora.

8. Célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido LovD variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Método de fabricación de un polipéptido LovD variante que comprende cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 8 en condiciones en las que se expresa el polipéptido LovD variante y opcionalmente recuperar el polipéptido LovD variante.

10. Método de fabricación de simvastatina que comprende poner en contacto un sustrato monacolina J con un 60 polipéptido LovD variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en presencia de un cosustrato tioéster de α-dimetilbutirilo y en condiciones en las que la monacolina J se convierte en simvastatina.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la monacolina J es una sal de sodio o una sal de amonio.

12. Método según la reivindicación 10 o la reivindicación 11 en el que se añade un agente para hacer precipitar la simvastatina, y en el que dicho agente es opcionalmente hidróxido de amonio.

13. Método de fabricación de simvastatina que comprende poner en contacto un sustrato lovastatina con un polipéptido LovD variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en presencia de un cosustrato tioéster de α-dimetilbutirilo y en condiciones en las que el sustrato lovastatina se convierte en simvastatina. 5

14. Método según la reivindicación 13, en el que: (a) dicho sustrato lovastatina, dicho polipéptido LovD variante y dicho tioéster se cargan sustancialmente al mismo tiempo en un recipiente; o (b) en el que se cargan primero dicho sustrato lovastatina y dicho polipéptido LovD variante en un recipiente y a continuación se carga dicho tioéster en dicho recipiente. 10

15. Método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que se añade un agente para hacer precipitar la simvastatina, y en el que dicho agente es opcionalmente hidróxido de amonio.