Péptidos HER-2.

Una composición que comprende un péptido quimérico, en la que el péptido quimérico comprende un epítopo B de HER-2,

un epítopo auxiliar T (Th) y un enlazador que une el epítopo B de HER-2 al epítopo Th, en la que:

la secuencia del epítopo B de HER-2 es

LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV (SEC ID Nº 6);

el epítopo Th comprende una secuencia seleccionada entre: KLLSLIKGVIVHRLEGVE (SEC ID Nº 10);

NSVDDALINSTIYSYFPSV (SEC ID Nº 11); PGINGKAIHLVNNQSSE (SEC ID Nº 12); QYIKANSKFIGITEL (SEC ID Nº 13); FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID Nº 14); LSEIKGVIVHRLEGV (SEC ID Nº 15);

FFLLTRILTIPQSLN (SEC ID Nº 16); o TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (SEC ID Nº 17);

y

el enlazador es de 1 a 15 aminoácidos.

Péptidos HER-2 Apoyo gubernamental

El trabajo descrito en la presente solicitud fue apoyado, al menos en parte, por subvenciones NIH 5ROI CA 84356 del Instituto Nacional de Salud. El gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en la presente invención.

Antecedentes

En la actualidad, las metodologías más comunes para el tratamiento del cáncer de mama consisten en cirugía, intervención química y/o radioterapia. A menos que el cáncer se limite a una zona definida, no se puede eliminar solo con cirugía. Por consiguiente, tras la cirugía, a menudo se administra un tratamiento de radiación para destruir las células cancerosas que se encuentran cerca de la zona quirúrgica y que han evadido la cirugía. Los efectos secundarios de dicho tratamiento incluyen sensibilidad cutánea o picazón, interferencia con el sistema inmunológico, a veces náuseas y, rara vez, fibrosis por radiación en la que una parte afectada del pulmón se vuelve fibrosa. Tras la cirugía, también se puede emplear la quimioterapia. La quimioterapia utiliza fármacos que son tóxicos para las células cancerosas. Dado que no se trata de un sistema perfectamente selectivo, también se ven afectadas las células normales. Los efectos secundarios negativos incluyen náuseas, cansancio, pérdida de apetito, pérdida de cabello y diarrea.

En vista de dichas terapias actuales, se han hecho intentos por encontrar metodologías adicionales para el tratamiento del cáncer de mama. Una de dichas metodologías es la inmunoterapia. Una de las dianas para una metodología inmunoterapéutica es la proteína HER-2. La proteína HER-2, un producto del oncogén HER-2, se sobreexpresa en varios cánceres. Se encuentra en el 5-6 % de los carcinomas ductales in situ y en el 2-4 % de todos los cánceres de mama, así como en una fracción sustancial de los adenocarcinomas que aparecen en los ovarios, la próstata, el colon y los pulmones. La sobreexpresión de la proteína HER-2 se relaciona con la transformación maligna en los seres humanos. La sobreexpresión de la proteína HER-2 también está íntimamente ligada a la agresividad del tumor maligno, encontrándose en una cuarta parte de todos los cánceres de mama invasivos. La sobreexpresión de la proteína HER-2 se correlaciona con un mal pronóstico del cáncer de mama y de ovario.

En estudios recientes, se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión extracelular (ECD) de HER-2 confieren efectos inhibidores sobre el crecimiento tumoral in vitro y en modelos animales (Hudziak, R. M., et al., Mol. Cell. Biol., 9:11-65-72, 1989; Tagliabue, E., etal., Int. J. Cáncer 47:933-7, 1991; Drebin, J. A., ef al., Proc. Natil. Acad. Scie. EE.UU. 83:9129-33, 1986; Drebin, J. A., etal., Oncogene, 2:273-7, 1988; Drebin, J. A., etal., Oncogene, 2:387-94, 1988y Katsumata, M., etal., Nat. Med. 1:644-8. 1995). Además, en ensayos clínicos en Fase II y III de un anticuerpo monoclonal anti-HER-2 humanizado recombinante, trastuzumab, en pacientes con metástasis, los cánceres de mama que sobreexpresaban HER-2 produjeron una tasa de respuesta global del 15 % como agente único. También se ha demostrado que el anticuerpo trastuzumab mejora la supervivencia cuando se combina con agentes quimioterapéuticos citotóxicos (Baselga, J., etal., J. Clin. Oncol. 14:737-44, 1996; Pegram, M. D., et al., J. Clin. Oncol., 16:2659-71, 1988). También se ha evaluado una serie de metodologías de vacunación dirigidas a una proteína HER-2 recombinante, el ECD de HER-2 o el ECD de neu de rata, que es el homólogo en ratas de HER-2. Por ejemplo, la cepa de ratones NFS inmunizados con un virus vaccinia recombinante que expresa el ECD de neu de rata desarrolló una respuesta de anticuerpos protectora contra la estimulación subsiguiente con células NIH 3T3 transformadas por neu (Bernards, R., etal., Proc. Nati. Acad. Sel. EE.UU., 84: 6854-8, 1987). La inmunización de las ratas BDIX con el mismo inmunógeno, sin embargo, no dio lugar a la respuesta de los anticuerpos ni tampoco inhibió el crecimiento de células singénicas de neuroblastoma B 14 que expresaban neu, lo que sugiere que esta estrategia fue insuficiente para inducir respuestas inmunes en la rata. Una vacuna de complejo de polisacáridos y oncoproteínas, que consiste en los 147 aminoácidos amino-terminales del ECD de HER-2 formando un complejo con manano y pululano portadores de grupos colesterilo, indujo respuestas inmunes celulares y humorales que mediaron el rechazo de sarcomas de expresión de HER-2 en ratones BALB/c (Gu, X. G., et al., Cáncer Res., 58: 3385-9, 1998). Se demostró la protección parcial en ratones transgénicos con neu de rata destinados a desarrollar tumores mamarios mediante la inmunización, bien con ECD de neu de rata purificada (Esserman, L. J., Cáncer Immunol. Immunother., 47:337-42, 1999) o fibroblastos murinos alogénicos transfectados con neu (Cefai, D., et al., Int. J. Cáncer, 83:393-4, 1999).

A pesar de los resultados de los estudios descritos anteriormente, todavía no está claro si se pueden generar respuestas inmunes eficaces en los seres humanos usando estrategias de vacunación basadas en células o en proteínas dirigidas a HER-2 o al ECD de HER-2, pues HER-2 es un auto-antígeno no mutado. Por consiguiente, es deseable tener metodologías inmunoterapéuticas adicionales para tratar o prevenir el cáncer de mama y otros tumores malignos vinculados con la sobreexpresión de la proteína HER-2.

El documento W21/8636 desvela composiciones para la estimulación del sistema inmune y para el tratamiento de tumores malignos asociados con la sobreexpresión de la proteína HER-2. Las composiciones desveladas

incluyen epítopos inmunogénicos de las proteínas HER-2, y péptidos quiméricos y multivalentes que comprenden dichos epítopos.

Sumario

De acuerdo con realizaciones, se proporciona un epítopo B de HER-2. El epítopo tiene una secuencia de LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV.

Las realizaciones de la invención se describen con más detalle en el presente documento.

Breve descripción de las diversas vistas de las figuras

La siguiente descripción detallada se puede comprender mejor si se lee junto con las siguientes figuras, en las que las estructuras similares se indican con números de referencia similares, y en las que:

La Figura 1 ¡lustra la secuencia de la proteína HER-2.

La Figura 2 muestra la estrategia sintética para 3 enlaces disulfuro. Se usaron protección de cisterna diferencial, y eliminación y oxidación selectivas para generar los enlaces disulfuro correctos como se ilustra.

La Figura 3 muestra la respuesta inmune en ratones FVB/n. Se inmunizaron grupos de cuatro a diez ratones FVB/n con las construcciones peptídicas lineales (NC) o de enlace disulfuro (SS) (A) MVF563-598, (B) MVF585- 598, (C) MVF597-626 o el péptido lineal (D) MVF613-626. Cada ratón se representa como una barra individual. Cabe señalar que la escala de A es diferente de la de B-D.

La Figura 4 muestra que trastuzumab reconoce específicamente epítopos de péptidos diseñados para imitar el sitio de unión a trastuzumab de HER-2. Las secuencias peptídicas se dan en el eje X. MVF316-339 es un péptido de control ¡relevante Her-2.

La Figura 5 muestra la citometría de flujo de anticuerpos específicos del péptido con células de cáncer de mama humanas que sobreexpresan HER-2. La citometría de flujo se usó para evaluar si los anticuerpos de los ratones FVB/n inducidos por diversas construcciones reconocían la HER-2 nativa. Se trataron células de cáncer de mama humanas BT-474 (HER-2high) con 1 pg/ml de Ig de ratón normal (control negativo), Ab-2 monoclonal de ratón (control positivo) o anticuerpos peptídicos generados en ratones FVB/n.

La Figura 6 muestra los sitios de unión a trastuzumab con HER-2.

La Figura 7 muestra la estructura tridimensional de epítopos peptídicos de herceptina.

La Figura 8 muestra la estructura de HER-2 unida a Omnitarg1 (Pertuzumab).

La Figura 9 muestra el sitio de unión a trastuzumab de HER-2. (A) Diagrama de cintas de HER-2 y la cadena pesada y ligera del complejo de trastuzumab. (B) Sitio de unión a trastuzumab de HER-2. Esta región es rica en disulfuro. Se indican las secuencias de los tres bucles que interactúan con trastuzumab.

La Figura 1 muestra la unión de trastuzumab a péptidos. Se recubrieron pocilios de microtitulación durante una noche con 2 pg/ml de diversos péptidos y luego se bloquearon con BSA al 1 % durante una hora. A continuación, se añadió trastuzumab a las placas a una concentración de 2. pg/ml y se diluyeron en serie a 1:2 con PBT. Se detectó el trastuzumab unido con IgG anti-humana conjugada con HRP y luego con sustrato. (A) Valor de DO415 para los péptidos de la Tabla... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un péptido quimérico, en la que el péptido quimérico comprende un epítopo B de HER-2, un epítopo auxiliar T (Th) y un enlazador que une el epítopo B de HER-2 al epítopo Th, en la que:

la secuencia del epítopo B de HER-2 es LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCV (SEC ID N2 6);

el epítopo Th comprende una secuencia seleccionada entre: KLLSLIKGVIVHRLEGVE (SEC ID Ns 1); NSVDDALINSTIYSYFPSV (SEC ID N2 11); PGINGKAIHLVNNQSSE (SEC ID N2 12); QYIKANSKFIGITEL (SEC ID N2 13); FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID N2 14); LSEIKGVIVHRLEGV (SEC ID N2 15); FFLLTRILTIPQSLN (SEC ID N2 16); o TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (SEC ID N217);

y

el enlazador es de 1 a 15 aminoácidos.

2. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que al menos uno entre el epítopo B de HER-2, el epítopo Th o el enlazador está en forma retroinversa.

3. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el enlazador comprende de 2 a 15 aminoácidos.

4. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el enlazador comprende GPSL (SEC ID N2 18).

5. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de NSVDDALINSTIYSYFPSV (SEC ID N211).

6. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de PGINGKAIHLVNNQSSE (SEC ID N212).

7. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de QYIKANSKFIGITEL (SEC ID N213).

8. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID N214).

9. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de LSEIKGVIVHRLEGV (SEC ID N2 15).

1. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de FFLLTRILTIPQSLN (SEC ID N2 16).

11. La composición según lo reivindicado en la reivindicación 1, en la que el epítopo Th tiene una secuencia de TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (SEC ID N2 17).

12. La composición de la reivindicación 1 para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmune.