Nuevas lipasas y usos de las mismas.

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 12.

Nuevas lipasas y usos de las mismas.

Campo de la invención La invención se refiere a una secuencia de polinucleótidos recién identificada que comprende un gen que codifica una nueva enzima lipolítica de Aspergillus niger. La invención presenta la secuencia de nucleótidos de longitud completa del nuevo gen, la secuencia de ADNc que comprende la secuencia codificadora de longitud completa de la nueva enzima lipolítica así como la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica de longitud completa y equivalentes funcionales de las mismas. La invención también se refiere a métodos para usar estas enzimas en procedimientos industriales y métodos para diagnosticar infecciones fúngicas. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención y células en las que se modifica genéticamente una enzima lipolítica según la invención para mejorar su actividad y/o nivel de expresión.

Antecedentes de la invención Los productos horneados tales como pan se preparan a partir de una masa que normalmente se hace de los ingredientes básicos harina (trigo) , agua y opcionalmente sal. Dependiendo de los productos horneados, otros ingredientes añadidos pueden ser azúcares, saborizantes, etcétera. Para productos leudados, principalmente se usa levadura de panadería junto a sistemas de leudado químico tales como una combinación de un ácido (compuesto generador) y bicarbonato.

Para mejorar las propiedades de manipulación de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados hay un continuo esfuerzo para desarrollar agentes auxiliares de elaboración con propiedades mejoradas. Se definen los agentes auxiliares de elaboración en la presente memoria como compuestos que mejoran las propiedades de manipulación de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados. Las propiedades de la masa que se pueden mejorar comprenden: mecanizabilidad, capacidad de retención de gases, pegajosidad reducida, elasticidad, extensibilidad, moldeabilidad, etcétera. Las propiedades de los productos horneados que se pueden mejorar comprenden: volumen de la barra de pan, carácter crujiente de la corteza, textura y suavidad de la miga, revenido relativo del sabor y tiempo de durabilidad. Estos agentes auxiliares de elaboración que mejoran la masa y/o el producto horneado se pueden dividir en dos grupos: aditivos químicos y enzimas (también referidas como enzimas para panadería) .

Las levaduras, enzimas y aditivos químicos se añaden en general por separado a la masa. La levadura se puede añadir como una suspensión líquida, en una forma comprimida o como levadura seca activa (ADY) o levadura seca instantánea (IDY) (ambas por sus siglas en inglés) . La diferencia entre estas formulaciones de levadura es el contenido de agua y de materia seca de levadura. La levadura líquida presenta un contenido de materia seca de levadura menor que 25% (p/v) . La levadura en crema es una forma particular de levadura líquida y presenta un contenido en materia seca entre 17 y 23% (p/v) . La levadura comprimida presenta un contenido de materia seca de levadura entre 25-35% (p/v) mientras las formulaciones de levadura seca presentan un contenido de materia seca de levadura entre 92-98% (p/v) .

Se pueden añadir enzimas en una forma seca, por ej., granulada o en forma líquida. Los aditivos químicos se añaden en la mayoría de los casos en forma de polvo. También, las composiciones de agente auxiliar de elaboración que se adaptan a aplicaciones de horneado específicas, pueden constar de una mezcla dedicada de aditivos químicos y enzima.

La preparación de una masa a partir de los ingredientes y agentes auxiliares de elaboración descritos anteriormente es conocida en la técnica y comprende mezclar dichos ingredientes y agentes auxiliares de elaboración y una o más etapas de moldeado y fermentación.

La preparación de productos horneados de dichas masas es también conocida en la técnica y puede comprender moldeado y conformación y fermentación adicional de la masa seguido por horneado a las temperaturas y tiempos de horneado requeridos.

Los aditivos químicos con propiedades mejoradas comprenden agentes oxidantes tales como: ácido ascórbico, bromato y azodicarbonato, agentes reductores tales como L-cisteína y glutatión, emulsionantes que actúan como acondicionadores de la masa tales como (por sus siglas en inglés) ésteres diacetil tartáricos de mono/diglicéridos (DATEM) , estearoil lactilato de sodio (SSL) o estearoil lactilato de calcio (CSL) o que actúan como suavizantes de la miga tales como monoestearato de glicerol (GMS) , etcétera, materiales grasos tales como triglicéridos (grasa) o lecitina y otros.

Como resultado de una necesidad motivada por el consumidor de reemplazar los aditivos químicos por productos más naturales, se han desarrollado diversas enzimas para panadería con propiedades de mejora de la masa y/o el producto horneado y que se usan en todas las combinaciones posibles dependiendo de las condiciones específicas de aplicación de horneado. Enzimas adecuadas incluyen enzimas que degradan el almidón, enzimas que degradan el

arabinoxilano y otras hemicelulosas, enzimas que degradan la celulosa, enzimas oxidantes, enzimas que rompen el material graso, enzimas de degradación, modificación o reticulación de proteínas.

Las enzimas que degradan el almidón son por ejemplo enzimas endo-actuantes tales como alfa-amilasa, amilasa maltogénica, pullulanasa u otras enzimas desrramificadoras y enzimas exo-actuantes que separan por escisión glucosa (amiloglucosidasa) , maltosa (beta-amilasa) , maltotriosa, maltotetraosa y oligosacáridos superiores.

El arabinoxilano y otras enzimas que degradan la hemicelulosa son por ejemplo xilanasas, pentosanasas, hemicelulasa, arabinofuranosidasa, glucanasa y otras.

Enzimas que degradan la celulosa son por ejemplo celulasa, cellobiohidrolasa y beta-glucosidasa.

Enzimas oxidantes son por ejemplo glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfhidril oxidasa, lipoxigenasa, laccasa, polifenol oxidasas y otras.

Enzimas que rompen el material graso son por ejemplo enzimas lipolíticas tales como triacilglicerol lipasas, fosfolipasas (tales como A1, A2, B, C y D) y galactolipasas.

Enzimas de degradación, modificación o reticulación de proteínas son por ejemplo proteasas endo-actuantes (serina proteasas, metaloproteasas, aspartil proteasas, tiol proteasas) , peptidasas exo-actuantes que separan por escisión un aminoácido o dipéptido, tripéptido, etcétera, de los extremos N-terminales (aminopeptidasas) o C-terminales (carboxipeptidasas) de la cadena de polipéptidos, enzimas desamidantes de asparaginas o glutamina tales como desamidasa y peptidoglutaminasa o enzimas reticulantes tales como transglutaminasa.

Se pueden producir convenientemente enzimas para panadería en microorganismos. Las enzimas microbianas para panadería están disponibles en una serie de fuentes; Bacillus spec, son una fuente común de enzimas bacterianas, mientras las enzimas fúngicas se producen comúnmente en Aspergillus spec.

Se pueden usar enzimas para panadería en una variedad de productos horneados. El término "productos horneados" se define en la presente memoria como que comprende productos de pan tales como: pan en lata, barras de pan, baguette así como panecillos, tartas, pasteles, magdalenas, rosquillas fermentadas con levadura y fermentadas químicamente y similares.

En los procedimientos anteriores, es ventajoso usar enzimas para panadería que se obtienen por técnicas de ADN recombinante. Dichas enzimas recombinantes presentan una serie de ventajas sobre sus equivalentes purificados de manera tradicional. Las enzimas recombinantes se pueden producir a un coste reducido, alto rendimiento, exentas de agentes contaminantes como bacterias o virus pero también exentas de toxinas bacterianas o contaminación de otras actividades enzimáticas.

Objeto de la invención Es un objeto de la invención proporcionar nuevos polinucleótidos que codifiquen nuevas enzimas lipolíticas con propiedades mejoradas. Un objeto más es proporcionar enzimas lipolíticas producidas de manera natural y de manera recombinante así como cepas recombinantes que las producen. También son parte de la invención polipéptidos de fusión así como métodos para preparar y usar los polinucleótidos y polipéptidos según la invención.

También es un objeto de la invención proporcionar nuevas enzimas lipolíticas, que resuelvan al menos uno de los problemas ya mencionados o proporcionen nuevas enzimas lipolíticas, que presenten una o más propiedades mejoradas si se usan en masa y/o productos horneados, seleccionadas del grupo de fuerza mejorada... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº 12.

2. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 10 y 11.

3. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 10 y 11.

4. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos según las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de polinucleótidos según las reivindicaciones 1 a 3 está ligado de manera operativa con secuencias reguladoras adecuadas para expresión de dicha secuencia de polinucleótidos en una célula huésped adecuada.

6. Un vector según la reivindicación 5, en el que dicha célula huésped adecuada es un hongo filamentoso.

7. Un método para preparar un polinucleótido según las reivindicaciones 1 -3 o un vector según las reivindicaciones 4 a 6, que comprende las etapas de cultivar una célula huésped transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula huésped.

8. Una enzima lipolítica aislada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 12.

9. Una enzima lipolítica aislada que se puede obtener por expresión de un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 3 o un vector según las reivindicaciones 4 a 6 en una célula huésped apropiada, por ej., Aspergillus niger.

10. Un método para fabricar una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9, que comprende las etapas de transformar una célula huésped adecuada con un polinucleótido aislado según las reivindicaciones 1 a 3 o un vector según las reivindicaciones 4 a 6, cultivar dicha célula en condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente purificar el polipéptido codificado de dicha célula o medio de cultivo.

11. Una célula huésped recombinante que comprende un vector según las reivindicaciones 4 a 6.

12. Una célula huésped recombinante que sobreexpresa una enzima lipolítica según las reivindicaciones 8 a 10.

13. Anticuerpos purificados reactivos con una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9.

14. Proteína de fusión que comprende una secuencia de enzimas lipolíticas según la reivindicación 8 ó 9.

15. Un procedimiento para la producción de masa que comprende incorporar una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9 a la masa.

16. Un procedimiento para la producción de un producto horneado de una masa como se prepara por el procedimiento de la reivindicación 15.

17. Uso de una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9 para la preparación de una masa y/o un producto horneado de la misma.

18. Una pre-mezcla que comprende una enzima lipolítica según la reivindicación 8 ó 9 y harina.