Neutralización de anticuerpos contra GDF-8 y usos de los mismos.

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que específicamente se une GDF-8,

comprende:

un (VH) de anticuerpo de dominio de región variable, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 31, VH CDR2

comprime SEQ ID NO: 32, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 33; y

un (VL) de anticuerpo de dominio de región liviana, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 34, VH CDR2

comprime SEQ ID NO: 35, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 36.

Neutralización de anticuerpos contra GDF-8 y usos de los mismos.

CAMPO TÉCNICO 5

El campo técnico se refiere a anticuerpos contra el factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF-8) , en particular anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos, especialmente aquellos que inhiben GDF-8 actividad in vitro y / o in vivo. El campo se refiere además a diagnosticar, prevenir, o tratar trastornos degenerativos de músculos o huesos, o trastornos del metabolismo de la insulina. 10

ANTECEDENTES

Factor de crecimiento y diferenciación-8 (GDF-8) , también conocido como miostatina, es una proteína secretada y es miembro del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-ß) superfamilia de factores de 15 crecimiento estructuralmente relacionados, todos los cuales poseen fisiológicamente importante propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas (Kingsley et al (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al (1998) Curr Topics Microbiol Immunol, 228: 235-272) . De manera similar a TGF-ß, GDF-8 humana se sintetiza como una proteína precursora larga 375 de aminoácidos. La proteína precursora de GDF-8 forma un homodímero. Durante el procesamiento del propéptido amino-terminal se escinde en Arg-266. El propéptido escindido, conocido como el 20 "péptido asociado a la latencia" (LAP) , puede permanecer no covalentemente unido a la homodímero, inactivando así el complejo (Miyazono et al (1988) J. Biol Chem., 263: 6.407 a 6.415; Wakefield et al (1988) J. Biol Chem., 263: 7.646 hasta 7.654; Brown et al (1990) Factores de Crecimiento, 3: 35-43; y Thies et al Factores (2001) Crecimiento, 18: 251 -259) . El complejo de GDF maduro-8 con propéptido se conoce comúnmente como el "pequeño complejo latente" (Gentr y et al (1990) Biochemistr y , 29: 6851 a 6857; Der y nck et al (1995) Nature, 316: 701-705; y Massague 25 (1990) Ann Rev. Cell Biol., 12: 597-641) . Se conoce que otras proteínas también se unen a madurar GDF-8 e inhibir su actividad biológica. Tales proteínas inhibidoras incluyen folistatina y proteínas relacionadas con la folistatina (Gamer-et al (1999) Dev Biol, 208: 222-232) .

Un alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas de varias especies demuestra que GDF-8 está 30 altamente conservado durante la evolución (McPherson y colaboradores (1997) Proc Nat Acad Sci EE.UU., 94: 12457 a 12.461) . De hecho, las secuencias de humano, ratón, rata, porcino, pollo y GDF-8 son 100% idénticas en la región C-terminal, mientras que en babuino, bovina, ovina y sólo se diferencian por 3 aminoácidos. El pez cebra GDF-8 es el más divergente; Sin embargo, todavía es 88% idéntico al humano.

El alto grado de conservación sugiere que GDF-8 tiene una función esencial.GDF-8 se expresa altamente en el músculo esquelético en desarrollo y adulto y se encontró que están involucrados en la regulación de procesos biológicos críticos en el músculo y en la osteogénesis. Por ejemplo, GDF-8 el cuero de los ratones transgénicos se caracteriza por una marcada hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético (McPherron y colaboradores (1997) Nature, 387: 83-90) . Y la estructura ósea cortical alterada (Hamrick ycolaboradores (2000) Bone, 27 (3) : 343-40 349) . Son evidentes los incrementos similares en la masa del músculo esquelético en mutaciones de origen natural de GDF-8 en el ganado (Ashmore y colaboradores (1974) Crecimiento., 38: 501-507; Swatland y colaboradores (1994) J. Anim Sci, 38.: 752-757; McPherron y colaboradores (1997) Proc Nat Acad Sci EE.UU., 94: 12457 hasta 12461; y Kambadur y colaboradores (1997) Genome Res, 7: 910-915) . Los estudios han indicado que la atrofia muscular asociada con la infección por VIH está acompañada por un aumento en la expresión de GDF-8 (González-45 Cadavid et al (1998) Proc Nat Acad Sci EE.UU., 95: 14938-14943) . GDF-8 también ha sido implicado en la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, la creatina quinasa) y la proliferación de las células de mioblastos (WO 00/43781) . Además por sus propiedades reguladoras de crecimiento y morfogenéticas, se cree que GDF-8 es también involucrado en un número de otros procesos fisiológicos, incluyendo homeostasis de la glucosa en el desarrollo de la diabetes tipo 2, la tolerancia alterada a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo, 50 síndrome X) , resistencia a la insulina inducida por trauma, tales como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno, y trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad) (Kim et al (2001) . BBRC, 281: 902-906) .

Un número de trastornos humanos y animales se asocian con tejido muscular deteriorado funcionalmente, por ejemplo, distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne) , esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , 55 atrofia muscular, atrofia de los órganos, la fragilidad, congestiva enfermedad pulmonar obstructiva, sarcopenia, caquexia, y pérdida de masa muscular síndromes causados por otras enfermedades y condiciones. Hasta la fecha, muy pocas terapias fiables o eficaces han sido desarrolladas para tratar estos trastornos.

También hay un número de condiciones asociadas con una pérdida de hueso, que incluyen osteoporosis y 60 osteoartritis, especialmente en los ancianos y / o mujeres posmenopáusicas. Además, las enfermedades óseas metabólicas y trastornos incluyen baja masa ósea debido a la terapia crónica con glucocorticoides, insuficiencia gonadal prematura, supresión androgénica, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa. Actualmente los tratamientos disponibles para estas condiciones de trabajo mediante la inhibición de la resorción ósea. Una terapia que promueve la formación de hueso nuevo sería una alternativa deseable para estas terapias.

Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevas terapias que contribuyan a un aumento global de masa muscular y / o fuerza y / o densidad ósea, especialmente, en los seres humanos. 5

RESUMEN

Es uno de los objetos de la presente invención proporcionar métodos terapéuticos seguros y eficaces para el músculo y / o trastornos de huesos asociado. 10

Es otro objeto de la invención proporcionar métodos para aumentar la masa muscular y / o fuerza y / o la densidad ósea en los vertebrados.

Otro objeto de la invención es aún proporcionar inhibidores de GDF-8 que sean seguros y efectivos in vivo. 15

Sin embargo, otro objeto de la invención es proporcionar anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos que se unen GDF-8 con alta especificidad y afinidad.

En conformidad, un aspecto de invención provee un anticuerpo, o antígeno uniendo fragmentos de los 20 mismos, que específicamente unen GDF-8, de dicho anticuerpo o fragmento comprimiendo:

Un anticuerpo variable (VH) de la región pesada, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 31, VH CDR2 comprime SEQ ID NO: 32, y VH CDR3 comprime SEQ ID NO: 33, y

Un anticuerpo variable (VL) de la región liviana, donde VL CDR1 comprime SEQ ID NO: 34, VL CDR2 comprime SEQ ID NO: 35, y VL CDR3 comprime SEQ ID NO: 36 25

Otro aspecto de invención provee un anticuerpo, o antígeno uniendo fragmentos de los mismos, que específicamente unen GDF-8, dicho anticuerpos o fragmentos comprimiendo:

Un anticuerpo variable (VH) de la región pesada, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 37, VH CDR2 comprime SEQ ID NO: 38, y VH CDR3 comprime SEQ ID NO: 39, Y 30

Un anticuerpo variable (VL) de la región liviana, donde VL CDR1 comprime SEQ ID NO: 41, VH CDR3 comprime SEQ ID NO: 42.

Un aspecto extra de invención provee un anticuerpo, o antígeno uniendo fragmentos de los mismos, que específicamente unen GDF-8, dicho anticuerpos o fragmentos comprimiendo: 35

Un anticuerpo variable (VH) de la región pesada, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 43, VH CDR2 comprime SEQ ID NO: 44, y VH CDR3 comprime SEQ ID NO: 45, Y

Un anticuerpo variable (VL) de la región liviana, donde VL CDR1 comprime SEQ ID NO: 46, VL CDR2 comprime SEQ ID NO: 47, VL CDR3 comprime SEQ ID NO: 48.

Lo que también se provee de acuerdo a la invención es un anticuerpo aislado o fragmentos del mismo que específicamente unen GDF-8, donde dicho anticuerpo es un scFv comprimiendo una secuencia de amino ácidos seleccionada de un grupo de una secuencia de amino ácidos que consisten en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, la secuencia de amino ácidos codificada por el vector fagémido depositado en ATCC bajo un número de depósito PTA-4741, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, una secuencia de amino ácido codificada por un vector fagémido depositado 45 en ATCC bajo el número de depósito PTA-4739.

Otro aspecto de invención provee una composición farmacéutica comprimiendo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que específicamente se une GDF-8, comprende:

un (VH) de anticuerpo de dominio de región variable, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 31, VH CDR2 5 comprime SEQ ID NO: 32, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 33; y

un (VL) de anticuerpo de dominio de región liviana, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 34, VH CDR2 comprime SEQ ID NO: 35, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 36.

2. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que comprende un dominio VH y un dominio 10 VL, donde es seleccionado de un grupo de secuencia de amino ácidos que consiste en SEQ ID NO:

16, SEQ ID NO: 28 y una secuencia de amino ácido de dominio de VH codificado para que el vector fagémido depositado en ATCC bajo el número de depósitos PTA-4741, y

Donde dicho dominio VL es seleccionado de un grupo de secuencias de amino ácidos que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 30 y la secuencia de amino ácido del dominio VL codificado por el vector fagémido depositado en 15 ATCC bajo el número de depósito PTA-4741.

3. Un anticuerpo aislado de la reivindicación 1, consiste en:

dos cadenas pesadas, cada uno que consiste esencialmente en el dominio VH de la secuencia de aminoácidos de 20 SEQ ID NO: 28 y el dominio constante de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y dos cadenas ligeras, cada uno que consiste esencialmente en el dominio VL de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y el dominio constante de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

4. El anticuerpo o fragmento antígeno unido de la reivindicación 1, que específicamente une GDF-8, a dichos 25 anticuerpos o fragmentos que comprimen:

un (VH) de anticuerpo de dominio de región variable, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 37, VH CDR2 comprime SEQ ID NO: 38, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 39; y

un (VL) de anticuerpo de dominio de región liviana, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 40, VH CDR2 30 comprime SEQ ID NO: 41, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 42.

5. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 4, que comprende un dominio VH y uno VL,

Donde dicho dominio VH es seleccionado de un grupo de secuencias de amino ácidos que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 y la secuencia de amino ácido del dominio VH codificado por el vector fagémido depositado en 35 ATCC bajo el número de depósito PTA-4740; y.

Donde dicho dominio VL es seleccionado de un grupo de secuencias de amino ácidos que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24 y la secuencia de amino ácido del dominio VL codificado por el vector fagémido depositado en ATCC bajo el número de depósito PTA-4740.

6. El anticuerpo o fragmento de reivindicación 4 que consiste en:

dos cadenas pesadas, cada uno que consiste esencialmente en el dominio VH de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y el dominio constante de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y dos cadenas ligeras, cada uno que consiste esencialmente en el dominio VL de la secuencia de aminoácidos de 45 SEQ ID NO: 24 y el dominio constante de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

7. El anticuerpo o antígeno o fragmento del mismo, que específicamente une GDF-8, dicho anticuerpo o fragmento comprime:

un (VH) de anticuerpo de dominio de región variable, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 43, VH CDR2 50 comprime SEQ ID NO: 44, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 45; y

un (VL) de anticuerpo de dominio de región liviana, donde VH CDR1 comprime SEQ ID NO: 46, VH CDR2 comprime SEQ ID NO: 47, y CDR3 comprime SEQ ID NO: 48.

8. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 7, comprime un dominio VH y uno VL, 55

Donde dicho dominio VH es seleccionado de un grupo de secuencias de amino ácidos que consiste en SEQ ID NO: 4 y la secuencia de amino ácido del dominio VH codificado por el vector fagémido depositado en ATCC bajo el número de depósito PTA-4739; y.

Donde dicho dominio VL es seleccionado de un grupo de secuencias de amino ácidos que consiste en SEQ ID NO: 6, y la secuencia de amino ácido del dominio VL codificado por el vector fagémido depositado en ATCC bajo el 60 número de depósito PTA-4739.

9. El anticuerpo de la reivindicación 7, que consiste en:

dos cadenas pesadas, cada uno que consiste esencialmente en el dominio VH de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y el dominio constante de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; y 65

dos cadenas ligeras, cada uno que consiste esencialmente en el dominio VL de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y el dominio constante de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

10. El anticuerpo o fragmento que específicamente une GDF-8, donde dicho anticuerpo es un scFV que comprime una secuencia de amino ácidos seleccionado de una secuencia de amino ácidos que consiste en: SEQ ID NO: 14, 5 SEQ ID NO: 26, la secuencia de amino ácido codificado por un vector fagémido depositado en ATCC bajo el número de depósito PTA-4741, SEQ ID, NO: 8, SEQ ID NO: 20, la secuencia de amino ácidos codificada por un vector fagémido depositado en ATCC bajo el número de depósito PTA-4740, SEQ ID NO: 2 y la secuencia de amino ácido codificada por el vector fagémido en la ATCC bajo el número de depósito PTA-4739.

11. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, 2, 4, 5 y 7-9, además comprime un anticuerpo de cadenas pesadas de dominio constante de un humano de un subtipo de inmunoglobina seleccionado de un grupo que consiste lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, lgE y lgM.

12. El anticuerpo, o fragmento de la reivindicación 11, donde dichas cadenas de dominio constante es modificado 15 para alterar la función de constante dominio.

13. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1-9, además comprime un anticuerpo humano liviano de un dominio constante seleccionado de un grupo que consiste en una cadena liviana kappa de dominio constante y una cadena liviana lambda de dominio constante. 20

14. Un anticuerpo de la reivindicación 3, 6 o 9, donde la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO: 53 es modificado al menos de los sobrantes 117 0 120 para alterar la función de la región Fc.

15. Un anticuerpo o fragmento de las reivindicaciones 1-9, donde dichos anticuerpos o fragmentos son parcialmente 25 o completamente humanizados.

16. Un anticuerpo o fragmentos de las reivindicaciones 1-9, donde dicho anticuerpo o fragmentos están neutralizados.

17. Una composición farmacéutica que comprime un anticuerpo o fragmentos de las reivindicaciones 1-9 y un excipiente aceptable.

18. Uso de anticuerpos o fragmentos de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desorden mamario seleccionado de un grupo que consiste en un desorden muscular, uno 35 neuromuscular, u hueso degenerativo y un desorden de tejido.

19. Uso de anticuerpos o fragmentos de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de desorden mamario seleccionado de un grupo que consisten en una distrofia muscular. Una distrofia muscular Dúchenme, una atrofia muscular, sarcopenia, caquexia, síndrome de pérdida muscular, esclerosis lateral 40 amiotrofia, osteoartritis, intolerancia a la glucosa, trauma inducido por la resistencia de la insulina, diabetes de tipo 2, obesidad.

20. Uso de un anticuerpo o fragmento de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una distrofia muscular. 45

21. Uso del anticuerpo o fragmento de las reivindicaciones 1-9 en la preparación de un medicamento para incrementar la masa muscular de un mamario.

22. Un poli nucleótido aislado comprime una secuencia de ácido nucleico codifica que anticuerpo o fragmentos de 50 las reivindicaciones 1-9.

23. El poli nucleótido de la reivindicación 22, donde dicho poli nucleótido comprime una secuencia de ácido nucleico seleccionado de una grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID 55 NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, y SEQ ID NO: 29.

24. Un vector de expresión que comprime un poli nucleótido de las reivindicaciones de la 1-9.

25. Una célula de huéspedes aislados que expresan el anticuerpo o fragmentos de las reivindicaciones 1-9. 60

26. Un método de producción de anticuerpo o fragmentos, que comprime el paso de cultivar la célula huésped de la reivindicación 25 y recuperar el anticuerpo o fragmentos producidos.

27. El anticuerpo o fragmentos producidos por un método de la reivindicación 26. 65