Mutante de aminasa 5''-xmp específico de amoníaco.

Un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, preparado sustituyendo cisteína en la posición 86 de aminasa 5'-XMP con alanina,

serina o glicina, en el que la aminasa 5'-XMP tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.

Mutante de aminasa 5'-xmp especïfico de amonïaco Campo tïcnico La presente invenciïn se refiere, en general, a un procedimiento de preparaciïn de un mutante de aminasa de ïcido 5'-xantïlico (XMP) que tiene una actividad potenciada, un mutante de aminasa 5'-XMP preparado de acuerdo con el procedimiento, y un procedimiento para producir ïcido 5'-guanïlico (GMP) con eficacia potenciada y, mïs en particular, a un procedimiento de preparaciïn de un mutante de aminasa 5'-XMP especïficamente reactivo para amonïaco, un mutante de aminasa 5'-XMP especïfico de amonïaco preparado de acuerdo con el procedimiento, y un procedimiento de producciïn de 5'-GMP con alto rendimiento usando el mutante de aminasa 5'-XMP especïfico de amonïaco.

Tïcnica anterior

El ïcido 5'-guanïlico (GMP) compite con al ïcido 5'-inosïnico (IMP) como el potenciador del sabor mïs ampliamente usado. El 5'-GMP es una de las sustancias responsables del gusto de las setas. Por sï solo, el 5'-GMP no tiene mucho gusto, pero su efecto es notable cuando se usa en combinaciïn con 1-glutamato de monosodio (MSG) . El 5'-GMP crea un efecto potenciador del sabor sinïrgico en combinaciïn con el 5'-IMP.

Son conocidos varios procedimientos para producir 5'-GMP, incluyendo: (1) la extracciïn de ARN de levadura y la digestiïn enzimïtica del mismo, (2) fermentaciïn microbiana para la producciïn directa del mismo, (3) fermentaciïn microbiana para formar guanosina, seguido de fosforilaciïn quïmica de guanosina, (4) fermentaciïn microbiana para formar guanosina, seguido de fosforilaciïn microbiana de guanosina, (5) fermentaciïn microbiana para la producciïn de 5'-XMP, seguido de la conversiïn de 5'-XMP a 5'-GMP usando Cor y nebacterium spp, o (6) fermentaciïn microbiana para la producciïn de 5'-XMP, seguido de la conversiïn de 5'-XMP a 5'-GMP por E. coli. De estos procedimientos, el procedimiento (1) tiene problemas relacionados con el suministro de material y la economïa, y el procedimiento (2) sufre la desventaja de tener un bajo rendimiento de producciïn debido a que las membranas celulares son impermeables a 5'-GMP. Por estos motivos, en la industria se aplican tïpicamente los otros procedimientos.

In vivo, para la conversiïn de 5'-XMP a 5'-GMP, como en el caso de los procedimientos (5) y (6) , la aminasa 5'-XMP es la responsable, que cataliza las siguientes reacciones (Pantel et al. (1975) , J. Biol. Sei., 250 (7) , 2609-2613) .

1) 5'-XMP + ATP + NH3 → 5'-GMP + AMP + PPi ↑ Aminasa 5'-XMP

2) 5'-XMP + ATP + L-Glutamina → 5'-GMP + AMP + PPi + ïcido L-glutïmico ↑ Aminasa 5'-XMP

La aminasa 5'-XMP es un miembro de la superfamilia de glutamina amidotransferasas. Las glutamina amidotransferasas hidrolizan la glutamina en el grupo gamma-amida grupo para generar amonïaco. El amonïaco libre resultante se asimila en aminoïcidos, nucleïtidos, azïcares, coenzimas, y similares por medio de reacciones de polimerizaciïn. Las glutamina amidotransferasas tienen muchas sustancias objetivo diversas, pero el procedimiento por el que se hidroliza la glutamina para formar amonïaco se ha conservado bien durante la evoluciïn. Las glutamina amidotransferasas se han dividido en dos subfamilias: clase I y clase II. Las enzimas de clase I incluyen antranilato sintasa, carbamoil fosfato sintetasa, CTP sintetasa, formilglicinamidina sintetasa, ïcido 5'-xantïlico aminasa, imidazol glicerol fosfato sintasa, aminodesoxicorismato sintasa, y p-aminobenzoato sintasa. Todas estas enzimas usan, ademïs de glutamina, amonïaco externo como dador de amina (Cell Mol. Life Sei. 54, 205-222, 1998) . A diferencia de cïmo se transfiere el amonïaco, libre de glutamina, a un sustrato, se considera que el amonïaco externo se transfiere directamente a la transferasa.

En el contexto de la estructura de la proteïna, la aminasa 5'-XMP se puede separar en dos dominios bien definidos: uno que tiene actividad glutaminasa responsable de la hidrïlisis catalïtica de la glutamina y el otro dominio que tiene actividad transferasa (Nat. Str. Biol. 3 (1) , 74-86, 1996) . El dominio N-terminal con actividad glutaminasa es estructuralmente similar a la carbamoil fosfato sintetasa, que ha sido bien estudiada. La actividad glutaminasa se logra principalmente por una trïada catalïtica de residuos cisteïna, histidina y glutamato, lo que es similar al mecanismo catalïtico de la cisteïna proteasa (Cell Mol. Life Sei. 54, 205-222, 1998) . En particular, en E. coli, la cisteïna 86, la histidina 181 y el ïcido glutïmico 183 forman una trïada catalïtica. En el mecanismo enzimïtico de la glutaminasa, el residuo de cisteïna catalïtico forma un enlace tioïster gamma-glutamilo con glutamina, sirviendo la histidina como base para la hidrïlisis de glutamina en ïcido glutïmico y amonïaco (Fukuyama et al. Biochemistr y 3, 1448-1492, 1964; von der Saal et al. Biochemistr y 24, 5343-5350, 1985) . Por medio de un canal formado en la enzima, este amonïaco participa en la conversiïn del ïcido 5'-xantïlico en ïcido 5r-guanïlico (Raushel et al. Biochemistr y , 38 (25) , 7891-7899, 1999) .

La conversiïn catalizada por aminasa XMP de 5'-XMP en 5'-GMP usando amonïaco muestra el mismo mecanismo que el de la reacciïn usando L-glutamina, pero es ligeramente diferente en sus propiedades. La aminasa 5'-XMP, aunque es ïptima a pH 8, 3 para ambos sustratos, presenta dos o mïs veces como mucho actividad catalïtica para la L-glutamina que para el amonïaco (Pantel et al. (1975) , J. Biol. Sei., 250 (7) , 2609-2613) . La diferencia se incrementa a medida que el pH de la reacciïn se aproxima al neutro, lo que implica que la aminasa 5'-XMP no emplea una fase de soluciïn de amonïaco (NH3) , pero se aprovecha de la L-glutamina en la conversiïn de 5'-XMP en 5'-GMP in vivo.

Cuando se trata con el reactivo sulfhidrilo reactivo con cisteïna yodoacetamida o con el derivado de glutamina clorocetona o acivicina, la actividad de aminasa 5'-XMP disminuye con L-glutamina, pero permanece sin cambios con amonïaco, lo que indica que el residuo cisteïna en el sitio activo de la glutaminasa es esencial para la actividad dependiente de glutamina de la aminasa 5'-XMP, pero no para la actividad dependiente de amonïaco de la aminasa 5'-XMP (Zalkin y Truitt, J. Biol. Sei. 252 (15) , 5431-5436, 1977; Massiere y Badet-Denisot, Cell Mol. Life Sei. 54, 205-222, 1998) .

En el caso de la antranilato sintasa, que pertenece a la misma clase que la aminasa 5'-XMP, se informa de que la sustituciïn del residuo de cisteïna conservado con glicina suprime la actividad de antranilato sintasa dependiente de glutamina pero no la actividad dependiente de NH3 de la enzima (Paluh et al., J. Biol. Chem. 260, 1889-8601, 1985) . Ademïs, cuando el residuo de cisteïna conservado de la para-aminobenzoato sintasa se reemplaza por serina, la producciïn del aducto de tioïster de γ-glutamilo se atenïa, lo que da lugar a una disminuciïn en la producciïn de aminodesoxicorismato (Roux et al., Biochemistr y , 32, 3763-3768, 1993) . Al igual que para la carbamoil fosfato sintetasa, su actividad dependiente de glutamina tambiïn desaparece cuando el residuo de cisteïna conservado se reemplaza con serina o glicina (Rubino et al., J. Biol. Chem., 261, 11320-11327, 1986) .

Tïpicamente, puesto que las enzimas nativas han evolucionado hasta tener una actividad adecuada para las cïlulas, a menudo presentan propiedades inadecuadas para aplicaciones industriales debido a su baja actividad. Para superar este problema, se han estudiado tïpicamente en la tïcnica la clonaciïn gïnica de una enzima de interïs y la sobreexpresiïn de la misma. En la prïctica, se aislï exitosamente un gen de aminasa 5'-XMP (guaA) a partir de Escherichia coli natural y se clonï en un plïsmido de expresiïn inducible que se puede aplicar para la producciïn de 5'-GMP de 5'-XMP (Biosci. Biotech. Biochem. 61 (5) , 840-845, 1997) .

Otro procedimiento de incremento de la expresiïn de proteïnas de bacterias naturales usando resistencia a fïrmacos se describe en la publicaciïn de patente coreana abierta a inspecciïn pïblica n.ï 2000-004 0840. En esta publicaciïn, se proporciona una cepa mutante que tiene una actividad potenciada de aminasa 5'-XMP, que se prepara impartiendo resistencia a decoyinina a una cepa de Escherichia coli natural, para incrementar la expresiïn de un gen de interïs.

Los vectores de expresiïn inducible para uso general requieren inductores de expresiïn caros tales como IPTG, y por tanto no son adecuados para aplicaciones industriales que impliquen la producciïn de proteïnas en una gran escala. Un sistema de expresiïn constitutiva surge como soluciïn a este problema. Se ha informado de un gran nïmero de sistemas de expresiïn constitutiva. En particular, se desarrollï... [Seguir leyendo]

1. Un mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco, preparado sustituyendo cisteïna en la posiciïn 86 de aminas.

5. XMP con alanina, serina o glicina, en el que la aminas.

5. XMP tiene una secuencia de aminoïcidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.

2. El mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que la cisteïna en la posiciïn 86 estï sustituida con alanina.

3. El mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco de acuerdo con la reivindicaciïn 1, que tiene una secuencia de aminoïcidos representada por SEQ ID NO.: 16, 18, 20 o 22.

4. Una molïcula de ïcido nucleico que codifica el mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco de la 10 reivindicaciïn 1.

5. Un vector de expresiïn que lleva la molïcula de ïcido nucleico de la reivindicaciïn 4.

6. Un transformante procariota, transformado con el vector de expresiïn de la reivindicaciïn 5.

7. Un procedimiento para converti.

5. XMP e.

5. GMP, que comprende usar el mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco de una de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un procedimiento para preparar un mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco, que comprende sustituir un residuo cisteïna en la posiciïn 86 de una secuencia de aminoïcidos de aminas.

5. XMP que tiene una secuencia de aminoïcidos representada por SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, con alanina, glicina o serina, donde el mutante de aminas.

5. XMP especïfico de amonïaco es sustancialmente inactivo para glutamina, pero reacciona especïficamente con amonïaco para converti.

5. XMP e.

5. GMP a una eficacia potenciada.

[Fig. 1]

Ligaciïn

[Fig. 2]

Eliminaciïn del fragmento que contiene el gen GFP

[FIG. 5]

[FIG. 18]

Estabilidad de plïsmido