Métodos y kits para diagnosticar tumorigenicidad y determinar resistencia a los efectos antineoplásicos de la terapia antiestrógeno.

Un método para diagnosticar la tumorigenicidad del cáncer de mama en un paciente humano,

que comprende:

i. detectar GP88 en células de una muestra biológica obtenida de un paciente;

ii. determinar el número de células positivas para GP88 en dicha muestra; y

iii. determinar la proporción de células positivas para GP88 respecto al número total de células en dicha muestra biológica, en el que dicha proporción es indicativa de la tumorigenicidad del cáncer de mama, y en el que la muestra biológica que contiene las células de dicho paciente es una muestra de tejido de mama; GP88 en dichas células de dicho tejido de mama se detecta por inmunotinción con anticuerpo anti-GP88 humano; el número de células positivas para GP88 en dicha muestra se determina por examen microscópico; y una proporción de al menos 10% de células positivas para GP88 respecto al número total de células en dicho tejido de mama indica la tumorigenicidad del cáncer de mama.

Métodos y kits para diagnosticar tumorigenicidad y determinar resistencia a los efectos antineoplásicos de la terapia antiestrógeno Esta solicitud es una continuación de la Solicitud U.S. No. 09/880.842, presentada el 15 de junio, 2001, que es una continuación en parte de la Solicitud U.S. No. 09/456.886, presentada el 8 de diciembre, 1999, que es una divisional de la Solicitud U.S. No. 08/991.862, presentada el 16 de diciembre, 1997, que es una continuación en parte de la Solicitud U.S. No. 08/863.079, presentada el 23 de mayo, 1997, ahora abandonada.

Antecedentes de la invención La proliferación y diferenciación de células en organismos multicelulares están sometidas a un proceso altamente regulado. Una característica distintiva de las células cancerosas es la ausencia de control sobre este proceso; la proliferación y diferenciación están desrreguladas lo que resulta en un crecimiento incontrolado. Se han dirigido esfuerzos de investigación significativos hacia una mejor comprensión de esta diferencia entre células normales y tumorales. Un área del foco de la investigación es los factores de crecimiento y, más específicamente, la estimulación del crecimiento autocrino.

Los factores de crecimiento son polipéptidos que portan mensajes a las células respecto al crecimiento, diferenciación, migración y expresión génica. Típicamente, los factores de crecimiento son producidos en una célula y actúan en otra célula para estimular la proliferación. Sin embargo, determinadas células malignas, en cultivo, demuestran una dependencia mayor o absoluta en un mecanismo de crecimiento autocrino. Las células malignas que presentan este comportamiento autocrino sortean la regulación de la producción de los factores de crecimiento por otras células y, por lo tanto, tienen un crecimiento no regulado.

El estudio del control del crecimiento autocrino avanza en la comprensión de los mecanismos de crecimiento celular y da lugar a avances importantes en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Con este fin, se han estudiado varios factores de crecimiento, incluyendo los factores de crecimiento semejantes a la insulina ("IGF1" e "IGF2") , péptido liberador de gastrina ("GRP") , factores de crecimiento transformantes alfa y beta ("TGF-a" y "TGF-b") , y factor de crecimiento epidérmico ("EGF") .

La presente invención está dirigida a un factor de crecimiento descubierto recientemente. Este factor de crecimiento se descubrió en primer lugar en el medio de cultivo de "células PC" altamente tumorigénicas, una variante independiente de insulina aislada de la línea celular adipogénica derivada de teratoma 1246. Este factor de crecimiento se refiere en la presente memoria como "GP88". GP88 se ha purificado y caracterizado estructuralmente. La secuenciación de aminoácidos de GP88 indica que GP88 tiene similitudes en la secuencia e aminoácidos con el precursor granulina/epitelina de ratón.

Las granulinas/epitelinas ("grn/epi") son polipéptidos de 6 kDa y pertenecen a una nueva familia de polipéptidos ricos en doble cisteína. La Patente U.S. No. 5.416.192 (Shoyab et al.) está dirigida a epitelinas de 6 kDa, particularmente epitelina 1 y epitelina 2. Según Shoyab, ambas epitelinas están codificadas por un precursor común de 63, 5 kDa, que se procesa en formas más pequeñas tan pronto como se sintetiza, de manera que los únicos productos naturales encontrados en muestras biológicas son las formas de 6 kDa. Shoyab et al. enseña que el precursor de epitelina es biológicamente inactivo.

A diferencia de las enseñanzas de Shoyab et al, . el laboratorio del presente inventor ha demostrado que el precursor no siempre se procesa tan pronto como se sintetiza. Los estudios, realizador en parte por este inventor, han demostrado que el precursor (es decir, GP88) se secreta de hecho como una glicoproteína de 88 kDa con un resto carbohidrato unido en N de 20 kDa. El análisis de la secuencia N terminal de GP88 indica que GP88 empieza en el aminoácido 17 del precursor grn/epi, demostrando que los primeros 17 aminoácidos de la secuencia de proteína deducida a partir del ADNc precursor corresponden a un péptido señal compatible con el direccionamiento para la localización en la membrana o para secreción. A diferencia de las enseñanzas de Shoyab et al., GP88 es biológicamente activo y tiene actividad estimuladora del crecimiento, particularmente como un factor de crecimiento autocrino para las células productoras.

El cáncer de mama es una causa principal en todo el mundo de morbilidad y mortalidad entre las mujeres. Se sabe que el estrógeno es un estimulador primario para el crecimiento de las células de cáncer de mama humano positivas para el receptor de estrógeno (ER+) in vivo e in vitro. Aunque el estrógeno se requiere inicialmente para el establecimiento y proliferación de los tumores de mama, el desarrollo de los tumores independientes de estrógeno durante el curso del cáncer de mama es indicativo de un mal pronóstico. Se ha postulado que el efecto mitogénico del estrógeno en las células de cáncer de mama, está mediado, al menos parcialmente, por factores de crecimiento autocrinos, incluyendo factores de crecimiento regulados por estrógeno. Así, la identificación y caracterización de genes que responden a estrógeno, particularmente genes que codifican factores de crecimiento, contribuye a la comprensión de los efectos del estrógeno en las células de cáncer de mama.

El citrato de tamoxifeno ("tamoxifeno") es un antiestrógeno no esteroideo prescrito comúnmente a pacientes que padecen cáncer de mama que ha demostrado propiedades antiestrógenas y antineoplásicas potentes. Véase la

Patente U.S. No. 4.536.516. El tamoxifeno es un antagonista del receptor de estrógeno que compite con el estrógeno para la unión a los receptores de estrógeno. Otros antiestrógenos incluyen, raloxifeno, inhibidores de aromatasa (por ejemplo, Arimidex® (anastrozol) , Fenera®) , y reguladores a la baja del receptor de estrógeno (por ejemplo, Faslodex®) . Los efectos antiestrógenos del tamoxifeno pueden estas relacionados con su capacidad de competir con el estrógeno para los sitios de unión en tejidos diana. Otros antiestrógenos, tales como inhibidores de aromatasa, inhiben o reducen la cantidad de estrógeno disponible. Por ejemplo, los inhibidores de aromatasa evitan la conversión de andrógeno en estrógeno reduciendo de esta manera la cantidad de estrógeno disponible. Los reguladores a la baja del receptor de estrógeno inhiben o reducen el número de los receptores de estrógeno en la célula.

El tamoxifeno está disponible actualmente en comprimidos de 10 y 20 mg en AstraZeneca y Barr Laboratories con el nombre comercial Nolvadex® y está indicado para cáncer de mama metastásico, terapia adyuvante de cáncer de mama, carcinoma ductal in situ, y reducción de la incidencia del cáncer de mama en mujeres con alto riesgo de cáncer de mama. Así, el tamoxifeno puede usarse para tratar y prevenir varios cánceres y particularmente cáncer de mama.

La administración de tamoxifeno, sin embargo, lleva consigo riesgos potencialmente graves para el paciente. Por ejemplo, la administración de tamoxifeno se ha asociado con un riesgo incrementado de cáncer de ovario. Además, algunos pacientes presentan resistencia a los efectos beneficiosos pretendidos del tamoxifeno. Por lo tanto, la administración de tamoxifeno a un paciente que es resistente a sus beneficios causa un daño innecesario al paciente incrementando el riesgo de cáncer de ovario y, la mismo tiempo, retrasando o causando que el paciente renuncie a tratamientos más efectivos.

De acuerdo con esto, la administración de tamoxifeno debe limitarse a aquellos pacientes que más probablemente se beneficiarían del tratamiento con tamoxifeno. Una determinación exacta de si un paciente será susceptible o resistente a los efectos antineoplásicos de la administración de tamoxifeno, antes de empezar dicho curso de tratamiento, sería una herramienta de diagnóstico valiosa.

La técnica enseña actualmente que la ausencia de receptor de estrógeno en un paciente corresponde con resistencia a tamoxifeno. Los pacientes con cáncer se ensayan rutinariamente para la presencia o ausencia del receptor de estrógeno en un intento de predecir si el paciente será resistente o responderá a terapia con tamoxifeno. Tomando como base el ensayo actual, a los pacientes con cáncer que son positivos en el ensayo para la presencia de receptores de estrógeno ("ER+" o "pacientes positivos para el receptor de estrógeno") se les prescribe típicamente tamoxifeno.

Sin embargo, un número significativo de pacientes ER+ son de hecho resistentes a tamoxifeno. Así, la prescripción rutinaria de tamoxifeno... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar la tumorigenicidad del cáncer de mama en un paciente humano, que comprende:

i. detectar GP88 en células de una muestra biológica obtenida de un paciente;

ii. determinar el número de células positivas para GP88 en dicha muestra; y iii. determinar la proporción de células positivas para GP88 respecto al número total de células en dicha muestra biológica, en el que dicha proporción es indicativa de la tumorigenicidad del cáncer de mama, y en el que la muestra biológica que contiene las células de dicho paciente es una muestra de tejido de mama; GP88 en dichas células de dicho tejido de mama se detecta por inmunotinción con anticuerpo anti-GP88 humano; el número de células positivas para GP88 en dicha muestra se determina por examen microscópico; y una proporción de al menos 10%

de células positivas para GP88 respecto al número total de células en dicho tejido de mama indica la tumorigenicidad del cáncer de mama.