Métodos para invertir la metilación por selección dirigida de DNMT3A y DNMT3B.

Uno o más miR-29 para su uso en la restauración de un patrón de metilación de ADN deseado en cáncer de pulmón,

que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B, en donde el uno o más miR-29 se seleccionan del grupo que consiste en miR-29a y miR- 29c y el cáncer de pulmón es un carcinoma pulmonar no microcítico.

Métodos para invertir la metilación por selección dirigida de DNMT3A y DNMT3B Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N2 6/962.795 presentada el 31 de julio de 27.

Declaración con respecto a la investigación financiada por el Gobierno Federal

La presente invención se realizó sin subvención Gubernamental por lo que el Gobierno no tiene ningún derecho sobre la misma.

Antecedentes

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos, con una frecuencia de aproximadamente 213. nuevos casos cada año y una mortalidad muy alta15. A pesar de nuevos fármacos y de regímenes terapéuticos, el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón no ha cambiado significativamente en los últimos 2 años, resaltando la necesidad de nuevas estrategias de tratamiento. La selección dirigida del epigenoma, representa una estrategia terapéutica prometedora en el cáncer16.

Se ha observado que la metilación aberrante del ADN desempeña funciones importantes en el cáncer de pulmón17:

1) la metilación de promotores es uno de los mecanismos responsables del silenciamiento de GST182 (genes supresores de tumores), tales como CDKN2A, CDH13, FHIT, WWOX, CDH1 y RASSF1A;

2) la expresión del ARNm de las ADN metiltransferasas de mantenimiento y de novo, DNMT1 y DNMT3B, respectivamente, fue supuestamente elevado en el 53 % y 58 % de los 12 NSCLC, respectivamente y el nivel de ARNm de DNMT1 se mostró que era un factor de pronóstico independiente para la supervivencia13;

3) la expresión de las proteínas DNMT1, DNMT3A y DNMT3B es elevada en tumores de pulmón con respecto a tejido de pulmón normal12;

4) un polimorfismo específico en el promotor de DNMT3B humano, que aumenta significativamente la actividad del promotor, se ha asociado con un riesgo de cáncer de pulmón aumentado21;

5) la inhibición de la metilación del ADN mediada por DNMT1 redujo el cáncer de pulmón carcinogénico inducido por tabaco en ratones al >5 %22.

Los microARN (miARN), ARN no codificantes de 19-25 nucleótidos que regulan la expresión génica induciendo la inhibición traduccional o la escisión de sus ARNm diana a través del emparejamiento de bases con sitios parcial o completamente complementarios, están implicados en procesos biológicos críticos, incluyendo desarrollo, diferenciación celular, apoptosis y proliferación12 Recientemente, se han identificado perfiles de expresión específicos de miARN, con implicacions de diagnóstico y pronóstico, para cánceres específicos (refs. 3-5 para una revisión). De manera destacable, por ordenador se han previsto miembros de la familia miR-29, que previamente muestran estar regulados negativamente en NSCLC67, que son complementarios a sitios en las regiones 3 no traducidas (3 UTR, Untranslated Regions ) de los genes de DNMT3A y B, utilizando diferentes algoritmos de predicción de genes diana de miARN (PicTar8, TargetScan3.19, MiRanda1 y miRGen11) (Fig. 1).

Entre los miARN descritos regulados negativamente en cáncer de pulmón, la familia miR-29 (29a, 29b y 29c) tiene complementariedades intrigantes con las regiones 3 no traducidas (UTR) de DNMT3A y 3B (metil transferasas de novo)8"11, dos enzimas clave implicadas en la metilación del ADN, que con frecuencia están reguladas positivamente en cáncer de pulmón12 y asociadas con un mal pronóstico13.

Aunque ahora se piensa que los miARN desempeñan una función en la carcinogénesis, la expresión del miARN es diferente en cáncer de pulmón frente a su homólogo normal. Además, el significado de esta expresión aberrante es poco conocida.

Por lo tanto, existe una necesidad de determinar si el miR-29 puede dirigirse tanto a DNMT3A como a DNTM3B y si la restauración del miR-29 puede normalizar patrones de metilación aberrante en cánceres pulmonares tales como, por ejemplo, cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC, Non-Small Cell Lung Cáncer).

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto general, en este documento se describe un método para restaurar un patrón de metilación del ADN deseado en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B.

En otro aspecto general, en este documento se describe un método para inducir, en un sujeto que lo necesite, la reexpresión de genes supresores de tumores (GST) silenciada por metilación, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B. En determinadas realizaciones, el GST comprende un o más de FHIT y WWOX.

En otro aspecto general, en este documento se describe un método para inhibir la tumorigenicidad en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B.

Los métodos descritos en este documento son útiles en sujetos que padecen cáncer pulmonar no microcítico.

En otro aspecto, en este documento se describe un método útil para la regulación epigenética de cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC).

El miR-29b endógeno puede ser útil como un cebador para iniciar la retrotranscripción del ARNm de DNMT3B.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para reducir la metilación de ADN global que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 que se dirigen a DNMT3A y DNMT3B, donde la expresión del miR-29 contribuye a modificaciones epigenéticas del ADN en una célula cancerosa.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para realizar la hipometilación del ADN combinando al menos un análogo de nucleósido con uno o más miR-29 suficiente para bloquear las rutas de novo y de mantenimiento de DNMT. En determinadas realizaciones, el análogo de nucleósido comprende decitabina.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para aumentar la expresión de un gen supresor de tumor (GST) que comprende transfectar una célula con uno o más mi-R29s. En determinadas realizaciones, el GST comprende una o más de las proteínas FHIT y WWOX.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para inhibir el crecimiento celular in vitro y/o inducir la apoptosis con respecto a controles mezclados en las células, que comprende transfectar una o más células con uno o más miR-29.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para modular negativamente niveles de expresión de las enzimas FHIT y/o WWOX, que comprende regular la DNMT3A y/o DNMT3B transfectando la célula con uno o más miembros de la familia miR-29. En determinadas realizaciones, la célula es una célula de cáncer de pulmón.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para reducir la metilación de ADN global que comprende inducir la expresión de mi-R29s en células de cáncer de pulmón.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para reestablecer la expresión de GST que comprende inducir la expresión de mi-R29s en células de cáncer de pulmón.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para inhibir la tumorigenicidad que comprende inducir la expresión de mi-R29s en células de cáncer de pulmón.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para desarrollar una terapia epigenética utilizando miR- 29 sintético, en solitario o en combinación con otros tratamientos, para reactivar supresores tumorales y normalizar patrones de metilación aberrante en una célula de cáncer de pulmón.

En otro aspecto, en este documento se describe un método para diagnosticar si el sujeto tiene, está en riesgo de desarrollar, o tiene un pronóstico de supervivencia disminuido para, una enfermedad relacionada con cáncer de pulmón, que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de m¡R en una muestra de ensayo del sujeto; en el que una alteración en el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo, con respecto al nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, la enfermedad relacionada con cáncer de pulmón; y en el que el al menos un producto génico de miR se selecciona del grupo que consiste en miR29a, miR-29b, miR-29c y combinaciones de estos.

En otros aspectos adicionales, en este documento se describen marcadores asociados con un estado de diversas células inducido por cáncer de pulmón. Se ha descubierto que un nivel de expresión más alto de lo... [Seguir leyendo]

1. Uno o más miR-29 para su uso en la restauración de un patrón de metilación de ADN deseado en cáncer de pulmón, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B, en donde el uno o más m¡R-29 se seleccionan del grupo que consiste en miR-29a y miR- 29c y el cáncer de pulmón es un carcinoma pulmonar no microcítico.

2. Uno o más miR-29 para su uso en la inducción de la reexpresión de genes supresores de tumores (GST) silenciados por metilación en cáncer de pulmón, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más de miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B, en donde el uno o más miR-29 se seleccionan del grupo que consiste en miR-29a y miR-29c y el cáncer de pulmón es un carcinoma pulmonar no microcítico.

3. El uno o más miR-29 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el GST comprende uno o más de FHlTy WWOX.

4. Uno o más miR-29 para su uso en la inhibición de tumorigenicidad en cáncer de pulmón, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más miR-29 suficiente para dirigirse a una o más de DNMT3A y DNMT3B, en donde el uno o más miR-29 se seleccionan del grupo que consiste en miR-29a y m¡R-29c y el cáncer de pulmón es carcinoma pulmonar no microcítico.

5. Uno o más miR-29 para su uso en la reducción de la metilación del ADN global en cáncer de pulmón, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más m¡R-29 que se dirigen a DNMT3A y DNMT3B, en donde la expresión del miR-29 contribuye a modificaciones epigenéticas del ADN en una célula cancerosa, en donde el uno o más miR-29 se seleccionan del grupo que consiste en m¡R-29a y miR-29c y el cáncer de pulmón es carcinoma pulmonar no microcítico.

6. Una combinación de uno o más m¡R-29 y de al menos un análogo nucleosídico, para su uso en conseguir la hipometilación del ADN en cáncer de pulmón, siendo dicho uno o más miR-29 suficientes para bloquear las rutas de DNMT de novo y de mantenimiento, en donde el uno o más miR-29 se seleccionan del grupo que consiste en miR- 29a y miR-29c y el cáncer de pulmón es carcinoma pulmonar no microcítico.

7. La combinación de uno o más miR y de al menos un análogo nucleosídico para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el análogo nucleosídico comprende decitabina.

8. Uno o más miR-29 para su uso en el aumento de la expresión de un gen supresor de tumor (GST) en cáncer de pulmón, que comprende transfectar una célula de carcinoma pulmonar no microcítico con uno o más miR-29, en donde el uno o más miR-29 se seleccionan del grupo que consiste en miR-29a y miR-29c.

9. El uno o más miR-29 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el GST comprende una o más de las proteínas FHIT y WWOX.

1. miR-29 sintéticos para su uso en la reactivación de supresores tumorales y en la normalización de patrones de metilación aberrantes en una célula de carcinoma de pulmón no microcítico en el desarrollo de una terapia epigenética, siendo dicho uso en solitario o en combinación con otros tratamientos, en donde uno o más miR-29 se selecciona del grupo que consiste en miR-29a y miR-29c.

11. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un carcinoma pulmonar no microcítico, que comprende:

al menos un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR-29a, miR-29c y una combinación de los mismos; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.