Métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteínas.

Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante,

método que comprende las etapas secuenciales de:

a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio iónico, en donde el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, en condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tiene un pH lo suficientemente distinto del pI del polipéptido como para potenciar la carga del polipéptido y una fuerza iónica baja eficaz para prevenir el apantallamiento de las cargas por los iones del tampón, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y al por lo menos un contaminante, y

b. recuperar el polipéptido purificado del efluente.

Métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteínas

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a la purificación de proteínas. En particular, la invención se refiere a métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteína indígena.

Antecedentes de la invención

La purificación económica a gran escala de proteínas es un problema de importancia creciente para la industria biotecnológica. Generalmente, las proteínas se producen por cultivo celular, usando bien líneas celulares eucarióticas o procarióticas manipuladas genéticamente para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado que las células que se usan normalmente son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, habitualmente proporcionados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos con los que se alimenta a las células y procedentes de los subproductos de las células en sí mismas a una pureza suficiente para su uso como un producto terapéutico humano plantea un reto formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas de los residuos celulares inicialmente dependen del sitio de expresión de la proteína. Algunas proteínas se pueden secretar directamente de la célula al medio de crecimiento que la rodea; otras se realizan intracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de purificación implica la lisis de la célula, que puede llevarse a cabo por diversos métodos, que incluyen la rotura mecánica, el choque osmótico o los tratamientos enzimáticos. Dicha disrupción libera el contenido completo de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. Estos generalmente se eliminan por centrifugación diferencial o por filtración. El mismo problema surge, aunque a una menor escala, con proteínas que se secretan directamente debido a la muerte celular natural y a la liberación de proteínas intracelulares de la célula hospedadora en el curso de la ejecución de la producción de proteínas.

Una vez que se obtiene una solución clara que contiene la proteína de interés, se intenta su separación de las otras proteínas producidas por la célula habitualmente usando una combinación de distintas técnicas cromatográficas. Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobicidad, o tamaño. Hay varias resinas de cromatografía distintas disponibles para cada una de estas técnicas, que permiten adaptar con precisión el esquema de purificación a la proteína particular involucrada. La esencia de cada uno de estos métodos de separación es que puede provocarse que las proteínas se muevan a distintas velocidades bajando poruña columna larga, alcanzando una separación física que aumenta a medida que pasan más abajo en la columna, o bien que se adhieran de forma selectiva al medio de separación, eluyéndose después de modo diferencial por distintos solventes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna, y la proteína de interés no lo hace, es decir, la proteína de interés está presente en el "flujo continuo".

Las publicaciones que conciernen a la purificación de proteínas incluyen Fahrner et al., Biotechnol Genet Eng Rev. 21;18:31-27.

J. Chrom. A, 16, páginas 171-183 (Avramescu et al., 23) divulga un método para la purificación de péptidos basado en el uso de membranas de intercambio iónico. Avramescu et al. usan una técnica en la que una proteína se adsorbe en una membrana de intercambio iónico mientras otra pasa a través de esta. La proteína adsorbida se puede recuperar por elución.

Un proceso de purificación a gran escala típico se basa a menudo en el empleo de proteína A inmovilizada como la etapa de captura y purificación primaria en combinación con otras operaciones de columna. Las operaciones de la columna de proteína A en general dan una pureza relacionada con el producto por encima del 98 % con el lavado de la mayoría de las impurezas del proceso en la fracción del flujo continuo. Debido a esto, se considera que las unidades operativas del proceso consiguiente son las etapas de concentración, purificación o limpieza, responsables de la separación de los isómeros relacionados con el producto y la eliminación de las cantidades restantes de las proteínas/ADN de las células hospedadoras, proteína A lixiviada y virus.

Sumario de la invención

La invención del presente documento se refiere a métodos para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, cuyos métodos comprenden las etapas secuenciales de: (a)

pasar la composición a través de una membrana de intercambio iónico, donde el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, en condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tiene un pH lo suficientemente distinto del pl del polipéptido para potenciar la carga del polipéptido y una fuerza iónica baja eficaz para prevenir el apantallamiento de las cargas por los iones del tampón, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y el al menos un contaminante, y (b) recuperar el polipéptido purificado del efluente.

En una alternativa, la invención se refiere a un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, cuyo método comprende las etapas secuenciales de: (a) pasar la composición a través de una membrana de intercambio catiónico, donde el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, en condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido y una conductividad de ^ aproximadamente 4 mS/cm, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y el al menos un contaminante, y (b) recuperar el polipéptido purificado del efluente.

En otra alternativa, la invención se refiere a un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, cuyo método comprende las etapas secuenciales de: (a) pasar la composición a través de una membrana de intercambio aniónico, donde el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, en condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por encima del pl del polipéptido y una conductividad de aproximadamente 4 mS/cm, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y el al menos un contaminante, y (b) recuperar el polipéptido purificado del efluente.

En un aspecto, el contaminante es una proteína de ovario de hámster chino (CHOP). En otro aspecto, el polipéptido comprende una región CH2/CH3. En aún otro aspecto, el polipéptido es un anticuerpo. En aún otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En otros aspectos, los métodos además comprenden someter la composición que comprende el polipéptido a una o más etapa(s) de purificación adicional(es) bien antes, durante o después de las etapas de a hasta b, siendo la etapa de purificación, en una alternativa, cromatografía de afinidad de proteína A, y, en otra alternativa, cromatografía de intercambio iónico, usando una columna o membrana que funciona en modo unión/elución, de flujo continuo, o de desplazamiento de proteína indígena.

Además, la invención proporciona la preparación de una composición farmacéutica combinando el polipéptido purificado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Aclaramiento de CHOP para el conjunto de intercambio aniónico de AcMo 1 a pH 5,5, 6, mS/cm, Mustang S (pequeña escala, ,18 mi VM, 667 VM/h).

Figura 2. Aclaramiento de CHOP para el conjunto de intercambio aniónico de AcMo 2 a pH 5,5 y 6,4 mS/cm y a pH 8, y 5, mS/cm, Mustang S (pequeña escala, ,18 mi VM, 667 VM/h).

Figura 3. Rendimiento para el conjunto de intercambio aniónico de AcMo 2 a pH 5,5 y 6,4 mS/cm y a pH 8, y 5, mS/cm, Mustang S (pequeña escala, ,18 mi VM, 667 VM/h).

Figura 4. Aclaramiento de CHOP para el conjunto de proteína A de AcMo 1 a pH 5,5, 3,2 mS/cm, Mustang S (pequeña escala, ,18 mi VM, 1333 VM/h).

Figura 5. Capacidad de unión de CHOP (barras) y anticuerpo (línea) para AcMo 3 a pH 8,, Mustang... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, método que comprende las etapas secuenciales de:

a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio iónico, en donde el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, en condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tiene un pH lo suficientemente distinto del pl del polipéptido como para potenciar la carga del polipéptido y una fuerza iónica baja eficaz para prevenir el apantallamiento de las cargas por los iones del tampón, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y al por lo menos un contaminante, y

b. recuperar el polipéptido purificado del efluente.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la membrana de intercambio iónico tiene un tamaño de poro de ,1 a 1 pm.

3. Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, método que comprende las etapas secuenciales de:

a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio catiónico, en donde el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, a condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tenga un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido y una conductividad de á aproximadamente 4 mS/cm, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y al por lo menos un contaminante, y

b. recuperar el polipéptido purificado del efluente.

4. El método de la reivindicación 3 en el que el pH es de aproximadamente 4 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido.

5. El método de la reivindicación 3 en el que el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido.

6. El método de la reivindicación 3 en el que el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH por debajo del pl del polipéptido.

7. El método de la reivindicación 3 en el que el pH es de aproximadamente 1 unidad de pH por debajo del pl del polipéptido.

8. El método de la reivindicación 3 en el que la conductividad es á aproximadamente 2 mS/cm.

9. El método de la reivindicación 3 en el que la conductividad es á aproximadamente 1 mS/cm.

1. Un método para purificar un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y al menos un contaminante, método que comprende las etapas secuenciales de:

a. pasar la composición a través de una membrana de intercambio aniónico, en la que el polipéptido y la membrana tienen carga opuesta, en condiciones de funcionamiento que comprenden un tampón que tenga un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH por encima del pl del polipéptido y una conductividad de á aproximadamente 4 mS/cm, lo que causa que la membrana se una al polipéptido y al por lo menos un contaminante, y

b. recuperar el polipéptido purificado del efluente.

11. El método de la reivindicación 1 en el que el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 unidades de pH por encima del pl del polipéptido.

12. El método de la reivindicación 1 en el que el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH por encima del pl del polipéptido.

13. El método de la reivindicación 1 en el que el pH es de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH por encima del pl del polipéptido.

14. El método de la reivindicación 1 en el que el pH es de aproximadamente 1 unidad de pH por encima del pl del polipéptido.

15. El método de la reivindicación 1 en el que la conductividad es < aproximadamente 2 mS/cm.

16. El método de la reivindicación 1 en el que la conductividad es á aproximadamente 1 mS/cm.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16 en el que la membrana es un adsorbente en modo mixto.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 17 en el que el contaminante es una proteína de ovario de hámster chino (CHOP).

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 18 en el que el polipéptido comprende una región CH2/CH3.

2. El método de la reivindicación 19 en el que el polipéptido es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

21. El método de la reivindicación 2 en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 21 que además comprende someter la composición que comprende el polipéptido a una o más etapa(s) de purificación adicional(es) bien antes, durante o después de las etapas de a hasta b, siendo dicha etapa de purificación cromatografía de afinidad de proteína A.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 21 que además comprende someter la composición que comprende el polipéptido a una o más etapa(s) de purificación adicional(es) bien antes, durante o después de las etapas de a hasta b, siendo dicha etapa de purificación cromatografía de intercambio iónico.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 21 que además comprende someter la composición que comprende el polipéptido a una o más etapa(s) de purificación adicional(es) que se ejecutan de forma continua durante las etapas de a hasta b, siendo dicha etapa de purificación cromatografía de intercambio iónico.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 24 que además comprende preparar una composición farmacéutica combinando el polipéptido purificado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 25, en el que el polipéptido es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos de HER2, anticuerpos de EGFR, anticuerpos de CD2, anticuerpos de CD22, anticuerpos de VEGF, anticuerpo del receptor de VEGF, anticuerpos de IgE, anticuerpos del receptor de Apo-2 y anticuerpos de TNF-alfa.

27. El método de la reivindicación 26 en el que el anticuerpo es un anticuerpo de HER2 seleccionado del grupo que consiste en trastuzumab y pertuzumab.

28. El método de la reivindicación 26 en el que el anticuerpo es el anticuerpo de CD2 rituximab.

29. El método de la reivindicación 26 en el que el anticuerpo es el anticuerpo de VEGF bevacizumab.

3. El método de la reivindicación 26 en el que el anticuerpo es el anticuerpo de IgE omalizumab.