Métodos mejorados de síntesis proteica in vitro.

Un método para la síntesis de ARNm, ADN y/o polipéptidos en una mezcla de reacción libre de células que comprende un extracto celular de bacterias cultivadas en un medio que contiene glucosa y fosfato y/o es de E.

coli, una matriz para la producción de ARNm, ADN y/o polipéptidos; monómeros para sintetizar ARNm, ADN y/o polipéptidos, y tales co-factores, enzimas y otros reactivos que sean necesarios para la síntesis, en donde dicha mezcla de reacción está libre de polietilen glicol y comprende uno o más de entre espermina, espermidina y putrescina; comprendiendo el método:

la síntesis de dicho ARNm, ADN y/o polipéptidos en la mezcla de reacción libre de células, modificada para incluir:

al menos 10 mM y no más de 250 mM de una fuente de energía libre de fosfato; nucleósidos monofosfato en ausencia de nucleósidos trifosfato exógenos; y fosfato exógeno a una concentración de al menos 1 mM y no más de 20 mM.

Métodos mejorados de síntesis proteica in vitro

Antecedente de la invención

La síntesis dirigida de macromoléculas biológicas es uno de los grandes logros de la bioquímica. Con la llegada de la tecnología de ADN recombinante (ADNr) , se ha hecho posible el empleo de la maquinaria catalítica de la célula para producir una proteína deseada. Esto se puede conseguir en el ambiente celular o in vitro utilizando extractos derivados de las células.

La síntesis de proteínas libre de células ofrece varias ventajas sobre los métodos de expresión de proteínas convencionales, in vivo. Los sistemas libres de células se pueden dirigir en su mayoría, si no completamente, los recursos metabólicos de la célula hacia la producción exclusiva de una proteína. Además, la falta de una pared celular y componentes de membrana in vitro es ventajoso ya que permite el control del entorno de síntesis. Por ejemplo, se pueden cambiar los niveles de ARNt para reflejar el uso del codón de los genes que se van a expresar. También se pueden alterar el potencial redox, pH, o fuerza iónica con una mayor flexibilidad que in vivo ya que no hay que preocuparse del crecimiento o la viabilidad celular. Además, se puede conseguir fácilmente la recuperación de productos proteicos purificados, con el plegamiento apropiado.

La traducción in vitro también es reconocida por su capacidad de incorporar aminoácidos no naturales y marcados con isótopos así como su capacidad para producir proteínas que son inestables, insolubles, o citotóxicas in vivo. Además, la síntesis de proteínas libre de células evita los procesos laboriosos necesarios para la clonación y la transformación de células para la expresión de productos de nuevos genes in vivo, y ha llegado a ser una tecnología de base para este campo.

A pesar de todas las características prometedoras de la síntesis de proteínas libre de células, su uso práctico y su puesta en marcha a gran escala han estado limitados por varios obstáculos. Entre estos, los más importantes son los tiempos de reacción cortos y los bajos índices de producción de proteína, que dan lugar a rendimientos bajos de síntesis de proteína y un coste excesivo de reactivos. Además, se necesitan reactivos caros, y los métodos convencionales son ineficaces en el uso de estos caros reactivos.

Las reacciones particularmente útiles combinan la transcripción y traducción in vitro, proporcionando de esta manera un enlace directo entre una secuencia de ADN codificante y el producto proteico. Sin embargo, la necesidad 35 adicional de reactivos para producir ARNm se añade al coste total de la reacción. Se han tratado en publicaciones recientes muchas estrategias diferentes para la reducción del coste de las reacciones de transcripción in vitro, incluyendo la reutilización de las matrices de ADN y el empleo de protocolos de realimentación. Por ejemplo, véase Kern y Davis (1997) "Application of Solution Equilibrium Analysis to in -Vitro RNA Transcription" Biotechnology Progress 13:747-756; Kern y Davis (1999) "Application of a Fed-Batch System to Produce RNA by In-Vitro Transcription" Biotechnology Progress 15:174-184.

Se necesitan mejoras para optimizar los sistemas de transcripción/traducción in vitro. La eliminación continua de los subproductos inhibidores así como el suministro continuo de sustratos para la síntesis puede capacitar los sistemas de reacción continuos o semicontinuos para soportar la síntesis durante largos periodos de reacción. Sin embargo, 45 estas estrategias también pueden dar como resultado el uso ineficaz de los sustratos y por tanto unos altos costes. La aclaración de los productos inhibidores, y la prevención de su síntesis es de gran interés para el desarrollo de sistemas sintéticos in vitro. También es importante la reducción de los costes de reactivos. Con la presente tecnología, los costes de reactivos más importantes importantes incluyen los de la fuente de energía química, enzimas, matriz DNA y NTP. Los métodos para disminuir estos costes a la vez que se aumentan los rendimientos 50 son de gran interés.

Bibliografía relevante

Patente de EE. UU. 6.337.191 B1, Swartz et al. Kim y Swartz (2000) Biotechnol Prog. 16:385-390; Kim y Swartz 55 (2000) Biotechnol Lett. 22:1537-1542; Kim y Choi (2000) J Biotechnol. 84:27-32; Kim et al. (1996) Eur J Biochem.

239: 881-886; Kim y Swartz (2001) Biotechnol Bioeng 74:309-316; Davanloo et al., Proc Natal Acad Sci USA 81:2035-2039 (1984) ; Datsenko et al., Proc Natâ?l Acad Sci EE. UU. 97:6640-6645 (2000) ; Jewett et al. (2002) Prokar y otic systems for in vitro expression, in Gene Cloning and Expression Technologies (Weiner, M.P. y Lu, Q.: eds.) , Eaton Publishing, Westborough, MA., pp. 391-411; Spirin et al., Science 242:1162-1164 (1988) .

Cunningham y Ofengand (1990) Biotechniques 9:713-714 sugieren que la adición de pirofosfatasa inorgánica da como resultado rendimientos de reacción mayores al hidrolizar los pirofosfatos que se acumulan. El pirofosfato es inhibidor debido a que forma complejos con los iones libres de magnesio dejándolos menos disponibles para la reacción de transcripción.

Breckenridge y Davis (2000) Biotechnology Bioengineering 69:679-687 sugieren que se puede producir ARN por transcripción de las matrices ADN inmovilizadas en soportes sólidos tales como perlas de agarosa, con rendimientos comparables a la transcripción tradicional en fase de solución. La ventaja del ADN inmovilizado es que las matrices se pueden recuperar de la reacción y reutilizar en múltiples rondas, impidiendo desecharlas innecesariamente y reduciendo significativamente el coste en matrices ADN.

La Patente de EE. UU. nº 6.337.191 describe la síntesis de proteína in vitro utilizando intermediarios glucolíticos como fuente de energía; y la Patente de EE. UU. nº 6.168.931 describe el aumento de síntesis in vitro de macromoléculas biológicas utilizando un nuevo sistema de regeneración de ATP.

Sumario de la invención

Se proporcionan métodos mejorados como se definen en la reivindicación 1 para la síntesis in vitro de moléculas biológicas, proporcionando rendimientos mejores, costes más bajos, y mayor utilidad. Las reacciones mejoradas de síntesis de proteínas libres de células utilizan una fuente de energía libre de fosfatos para la producción de ATP, incluyendo por ejemplo, glucosa, glutamato, piruvato, etc. Los nucleósidos trifosfato se sustituyen opcionalmente por nucleósidos monofosfato. Estas mejorías disminuyen drásticamente los costes y aumentan la robustez de las reacciones de síntesis proteica libre de células.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de barras que compara el nivel de síntesis de proteínas in vitro con el sistema que compone la presente invención utilizando piruvato como fuente de energía y nucleósidos monofosfato más fosfato a varias concentraciones. Se determinó la expresión de CAT a partir de la incorporación de 14C-leucina. Las barras de error representan el intervalo de dos experimentos por separado. La Figura 2 es un gráfico de barras que compara el nivel de síntesis de proteína in vitro con el sistema que compone la presente invención utilizando glucosa como fuente de energía con nucleósidos trifosfato y varias cantidades de fosfato. Se determinó la expresión de CAT a partir de la incorporación de 14C-leucina. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos por separado. La Figura 3 es un gráfico de barras que compara el nivel de síntesis de proteína in vitro con el sistema que compone la presente invención utilizando glucosa como fuente de energía y varios componentes para las reacciones libres de células satisfactorias. Se determinó la expresión de CAT a partir de 14C-leucina. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos por separado. Figura 4: Efecto de 10 mM de fosfato adicional en las reacciones de síntesis de proteína libre de células utilizando glucosa como fuente de energía con o NTP o NMP. Las barras de error representan la desviación estándar de nueve experimentos (n=9) . Figura 5: Concentración de ATP en las reacciones libres de células que utilizan glucosa como fuente de energía con NTP o NMP. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos (n=3) . Figura 6. Expresión de CAT utilizando el sistema Cytomim con o sin adición de fosfato. Las reacciones (15 μl) se llevaron a cabo durante 6 horas y se determinó la expresión de CAT por la incorporación de 14C-leucina. Las barras de error representan la desviación estándar de once experimentos individuales. Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando el sistema Cytomim sin piruvato... [Seguir leyendo]

1. Un método para la síntesis de ARNm, ADN y/o polipéptidos en una mezcla de reacción libre de células que comprende un extracto celular de bacterias cultivadas en un medio que contiene glucosa y fosfato y/o es de E. coli, una matriz para la producción de ARNm, ADN y/o polipéptidos; monómeros para sintetizar ARNm, ADN y/o polipéptidos, y tales co-factores, enzimas y otros reactivos que sean necesarios para la síntesis, en donde dicha mezcla de reacción está libre de polietilen glicol y comprende uno o más de entre espermina, espermidina y putrescina; comprendiendo el método:

la síntesis de dicho ARNm, ADN y/o polipéptidos en la mezcla de reacción libre de células, modificada para incluir:

al menos 10 mM y no más de 250 mM de una fuente de energía libre de fosfato; nucleósidos monofosfato en ausencia de nucleósidos trifosfato exógenos; y fosfato exógeno a una concentración de al menos 1 mM y no 15 más de 20 mM.

2. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha fuente de energía libre de fosfato es glucosa.

3. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha fuente de energía libre de fosfato es glutamato. 20

4. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha fuente de energía libre de fosfato es piruvato.

5. El método de la Reivindicación 1, en el que dicho fosfato se proporciona como fosfato potásico, fosfato magnésico

o fosfato amónico. 25

6. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha síntesis comprende la traducción de ARNm para producir polipéptidos.

7. El método de la Reivindicación 6, en el que dicha síntesis también comprende la transcripción de ARNm a partir 30 de una matriz ADN.

8. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha síntesis de ARNm, ADN y/o polipéptidos se lleva a cabo como una reacción discontinua.

9. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha síntesis de ARNm, ADN y/o polipéptidos se lleva a cabo como una reacción continua.

10. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende un extracto de E. coli que se cultiva en un medio que contiene glucosa. 40

11. El método de la Reivindicación 10, en el que dicha E. coli se cultiva en un medio que contiene glucosa y fosfato.

12. El método de la Reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende magnesio a una concentración

desde 5mMa 20 mM. 45

13. El método de la Reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción da un rendimiento por encima de 400 μg/ml del polipéptido que se sintetiza.