Métodos de uso de secuencias de ácido nucleico como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1.

Método para la detección de ácido nucleico VIH-1 en una muestra en donde la muestra está sometida a una reacción de amplificación de ácido nucleico basada en la transcripción usando un par de oligonucleótidos como cebadores y reactivos adecuados de amplificación,

y se detecta la presencia de cualquier ácido nucleico amplificado, en donde el par de oligonucleótidos consiste en:

un primer oligonucleótido que tiene 26-50 nucleótidos de longitud y que compende la SEQ ID:1:

G GGC GCC ACT GCT AGA GA

y un segundo oligonucleótido que tiene 15-26 de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de SEQ ID:5:

CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA

en donde el primer oligonucleótido está unido operablemente a una secuencia promotora para uso como un cebador promotor.

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DESCRIPCIÓN

Métodos de uso de secuencias de ácido nucleico como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1

La presente invención se refiere a un método de detección de secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar en el campo del diagnóstico de virus, más específicamente en el diagnóstico de infecciones con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) que causa el SIDA.

Si bien el diagnóstico de virus convencional se ha basado predominantemente en la detección de antígenos víricos o anticuerpos específicos de ellos, en los últimos años la atención se ha desplazado hacia métodos para la detección directa del genoma de virus o secuencias de ácido nucleico derivadas del mismo, tanto ARN como ADN. Estos métodos se basan generalmente en la hibridación de ácido nucleico. La hibridación de ácido nucleico se basa en la capacidad de dos hebras de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias de emparejarse entre sí en condiciones apropiadas, formando así una estructura de doble hebra. Cuando se etiqueta la hebra complementaria, se puede detectar la etiqueta y es indicativa de la presencia de la secuencia diana. Especialmente en combinación con métodos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, estos métodos se han convertido en una herramienta importante de diagnóstico vírico, en particular para la detección de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) .

Las técnicas de amplificación de ácido nucleico son especialmente útiles como técnica adicional en los casos en los que los métodos serológicos ofrecen resultados dudosos o en los casos en los que puede existir un período de tiempo considerable entre la infección y el desarrollo de los anticuerpos para el virus. Con VIH, normalmente, la seroconversión se puede producir unos 3 a 6 meses después de la exposición al virus. Por tanto, aunque no se detecten anticuerpos con los inmunoensayos convencionales, pueden ser detectables ADN provírico o ARN vírico circulante. Asimismo, en terapia antivírica de seguimiento, los métodos basados en la amplificación de ácido nucleico presentan varias ventajas con respecto a los métodos serológicos. Especialmente, los métodos de amplificación cuantitativa proporcionan una poderosa herramienta para valorar los cambios en la cantidad de virus presentes antes y durante la terapia.

La elección de los oligonucleótidos que se han de utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de secuencias de ácido nucleico es crítica para la sensibilidad y especificidad del ensayo. Normalmente, la secuencia que se ha de amplificar está presente únicamente en una muestra (por ejemplo en una muestra de sangre obtenida de un enfermo que supuestamente padece la infección vírica) en cantidades diminutas. Los cebadores deberán ser suficientemente complementarios de la secuencia diana como para permitir una amplificación eficaz del ácido nucleico vírico presente en la muestra. Si los cebadores no se hibridan de forma apropiada (debido a un desapareamiento de las bases de los nucleótidos en ambas hebras) con la secuencia diana, la amplificación se verá seriamente dañada. Esto afectará a la sensibilidad del ensayo y puede tener como resultado unos resultados de ensayo negativos falsos. Debido a la heterogeneidad de los genomas víricos, se pueden obtener resultados de ensayo negativos falsos cuando los cebadores y las sondas son capaces de reconocer las secuencias presentes solamente en parte de las variantes del virus. El virus VIH presenta una alta heterogeneidad. Se ha demostrado la variabilidad genética entre aislados de diferentes continentes, pero también entre distintos individuos y entre diferentes estadios de la enfermedad. En función del análisis de secuencia, se han identificado dos grupos dentro de VIH-1: el grupo M (M de â??majorâ?? - principal) , y el grupo O (O de â??outlierâ?? anexo) . Dentro del grupo M, se han asignado subtipos (A-H) , que constituyen cada uno de ellos un grupo de secuencias por separado filogenético, y se están identificando otros adicionales. Esta variación de secuencia no está uniformemente distribuida en todo el genoma. El genoma VIH-1, al igual que todos los genomas retrovíricos, consiste de forma aproximada en las siguientes regiones: el gen gag del genoma VIH-1 es la región que codifica las proteínas de núcleo del virus (por ejemplo, p24) ; el gen env codifica una proteína de precursor grande, gp 160, que es procesada para convertirse en las proteínas de envuelta gp 120 y gp41. El gen pol codifica la polimerasa del virus (transcriptasa inversa) . Las regiones de Repetición Terminal Larga (LTR) son las regiones en el genoma vírico que participan en la integración del virus con la célula huésped y en la regulación de la transcripción de genes víricos. Algunas regiones son más propensas a la variación de secuencia que otras. Sobre todo, en la secuencia de dominio env, la variación puede alcanzar hasta un 30% entre miembros de los diferentes subtipos. De forma ideal, la selección del cebador se deberá basar en la información sobre la variabilidad entre una cepa en secuencias de cebador candidato y las consecuencias de falta de emparejamiento en sitios de cebador. McCutcheon et al., J. AIDS, 4, 1241-1250, 1991, utiliza PCR para realizar una comparación genética de diferentes aislados de VIH-1. Utilizando PCR anclada (se utilizaron cebadores de varios sentidos con un cebador antisentido constante; se seleccionaron cebadores de regiones relativamente conservadas en gag, env y LTR) . Se investigó el efecto del desapareamiento de cebador en la cantidad de producto de PCR obtenido. El desapareamiento en el extremo 3â? del cebador disminuyó la cantidad del producto a veces en más de 100 veces.

La detección de todos los subtipos de VIH-1 conocidos actualmente es de una importancia extrema, sobre todo en lo que se refiere al control del paciente, la seguridad de la sangre y los productos sanguíneos y los estudios clínicos y epidemiológicos. Los ensayos actuales para la amplificación y la posterior detección de secuencias de ácido nucleico derivadas de VIH-1 se basan normalmente en la amplificación de secuencias en la región gag del genoma vírico. Estos ensayos han sido desarrollados para el subtipo B, que es el principal subtipo en países europeos y en los

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Estados Unidos. Sin embargo, la presencia de otros subtipos, que estaban antes confinados geográficamente, está aumentando debido a los frecuentes desplazamientos entre estos países y, por ejemplo, países africanos. Por lo tanto, se necesitan ensayos sensibles con los que se puedan detectar tantas variantes de virus VIH-1 como sea posible (preferiblemente todas) .

La investigación dirigida a la identificación de grupos de cebadores adecuados para una amplificación fiable de secuencias de ácido nucleico derivadas de VIH-1 ha estado en curso durante los años pasados. Engelbrecht et al., J. Virol. Meth., 55, 391-400, 1995, describen un estudio dirigido al desarrollo de un protocolo de PCR específico y sensible utilizando pares de cebadores env, gag y LTR para detectar subtipos presentes en el Cabo Oeste, Sudáfrica. Se analizaron 24 cepas que, según se sabía, pertenecían a los subtipos B, C y D. Se observó que el comportamiento de los pares de cebador dependía en gran medida de la optimización de las condiciones de reacción para los diferentes pares de cebador. Únicamente cuando se utilizaron condiciones menos estrictas (por ejemplo, con el par de cebador LTR, se necesitaron un aumento del tiempo de ciclo y temperaturas de hibridación) se pudieron detectar estas cepas de VIH en particular con suficiente sensibilidad y reproducibilidad con todos los pares de cebador.

Zazzi et al. J. Med. Virol., 38, 172-174, 1992, desarrolló una reacción de PCR en dos etapas (utilizando cebadores anidados) para detectar ADN de VIH-1 en muestras clínicas. Los cebadores utilizados para la amplificación se derivaron del gen gag y de la región LTR. Los pacientes sometidos a ensayo en este estudio fueron todos ellos de zonas colindantes, lo que hace probable que representaran solamente un número limitado de diferentes cepas víricas.

Vener et al., en Bio Techniques, 21, 248-255, 1996 describen un método de PCR cuantitativo en el que se utilizan cebadores anidados derivados de LTR. Este procedimiento fue ensayado solamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , infectadas con VIH-1MN. Por lo tanto, no se puede decir nada de la adecuación de los cebadores utilizados para la detección de diferentes subtipos de virus. La invención... [Seguir leyendo]

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1. Método para la detección de ácido nucleico VIH-1 en una muestra en donde la muestra está sometida a una reacción de amplificación de ácido nucleico basada en la transcripción usando un par de oligonucleótidos como cebadores y reactivos adecuados de amplificación, y se detecta la presencia de cualquier ácido nucleico amplificado, en donde el par de oligonucleótidos consiste en:

un primer oligonucleótido que tien.

2. 50 nucleótidos de longitud y que compende la SEQ ID:1:

G GGC GCC ACT GCT AGA GA

y un segundo oligonucleótido que tiene 15-26 de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de SEQ ID:5:

CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA

en donde el primer oligonucleótido está unido operablemente a una secuencia promotora para uso como un cebador promotor.

2. Método según la reivindicación 1, en donde los reactivos de amplificación adecuados son transcriptasa inversa, RNasa H y ARN polimerasa T7

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde la detección de cualquier ácido nucleico amplificado se realiza haciendo reaccionar la muestra con uno o más oligonucleótidos seleccionados del grupo: SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT ó SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT

uno o más de los cuales están provistos de una etiqueta detectable en condiciones de hibridación adecuadas y detectándose la presencia de la etiqueta en cualquier híbrido formados entre la secuencia amplificada y la sonda.