Método para la preparación de un sustrato de recubrimiento termosensible, sustrato con un recubrimiento termosensible y su aplicación.

Método para preparar un sustrato con una capa de polímero termosensible de afinidad por el agua que puede cambiar (LCST) dentro de 0-80ºC,

en el que:

i. se limpia un sustrato de base de silicio o vidrio no orgánico y se modifica con grupos funcionales reactivos y entonces

ii. se inmoviliza un polímero termosensible mediante injerto de cadenas y formación de enlaces covalentes en una atmósfera protectora de argón y en una disolución,

caracterizado porque la inmovilización del polímero termosensible se realiza a partir de una disolución de homo y copolímeros vivos de 2-oxazolina 2-sustituida, donde se crean enlaces covalentes en la reacción entre:

los grupos de terminación nucleófilos del sustrato de base obtenidos como resultado de la modificación del sustrato y

el centro de propagación catiónico en el extremo de la cadena de los polímeros a partir de un grupo de 2-oxazolina 2-sustituida.

El objeto de esta invención es un método para preparar un sustrato con una capa termosensible, un sustrato con capa termosensible y aplicaciones para este sustrato.

El material está previsto para su uso en medicina regenerativa, biología, biotecnología y otros campos relacionados.

En el tratamiento de pacientes con quemaduras graves, se aplican numerosas soluciones que están previstas para intercambiar una herida de quemadura por una herida quirúrgica para prevenir la infección. El autotrasplante de piel es la mejor solución. Sin embargo, este método no siempre es eficaz debido a insuficientes sitios donadores. Aplicaciones alternativas de apósitos biológicos, es decir, xenoinjertos o aloinjertos de piel, proporcionan sólo una solución temporal debido a que, con el tiempo, son rechazados por el organismo del paciente e introducen una oportunidad para la infección con patógenos zoonóticos [1-3]. También pueden usarse sustitutos de piel obtenidos mediante ingeniería de tejidos. Se usan como componentes de la piel colágeno, glucosaminoglucanos, poliglicolida o ácido hialurónico o matrices biodegradables [4,5], Tales componentes constituyen una matriz que puede cubrirse con fibroblastos o queratinocitos obtenidos a través de cultivo in vitro. Sin embargo, la aplicación de estos componentes de la piel es bastante cara, y pueden producirse problemas en el proceso terapéutico. Además, la obtención de un número requerido de queratinocitos requiere mucho tiempo y muy a menudo da como resultado su muerte, reduciendo por tanto la eficacia del cultivo. Un cultivo de las propias células cutáneas de un paciente, tales como queratinocitos, y su aplicación individual a la herida es una alternativa a los métodos anteriores. No obstante, un procedimiento de este tipo revela deficiencias esenciales [3,6], La primera, tal como se describió anteriormente, se refiere al lento cultivo de los queratinocitos. Adicionalmente, tras la proliferación de las células, se usan métodos enzimáticos para separar las células del sustrato, pero las enzimas destruyen tanto la matriz extracelular producida por las células como proteínas importantes. Se disgregan láminas de células (es decir, tras el desprendimiento las células no están unidas entre sí), y la mayoría de ellas mueren. Entonces se aplican queratinocitos a la herida en forma de una suspensión y se crean agrupaciones de células. Por tanto, no es posible el control preciso sobre la disposición de las células para cubrir completamente una herida.

La bibliografía científica [7-10] y de patentes describe métodos de cultivo celular sobre sustratos de base sólida a los que se ha unido covalentemente un polímero termosensible. Tales polímeros y copolímeros presentan cambios reversibles en sus propiedades con los cambios en la temperatura; son solubles sólo por debajo de una temperatura dada y por encima de esa temperatura (la denominada temperatura de punto de enturbiamiento, Tcp) precipitan a partir de la disolución. Para un sustrato con una capa de polímero o copolímero termosensible con una afinidad por el agua que puede cambiar dentro del intervalo de 0-80°C, el cultivo celular se realiza a una temperatura superior a la temperatura de disolución crítica inferior (LCST) del polímero a la que la superficie es hidrófoba. Tras la proliferación de las células, la temperatura de cultivo se reduce por debajo de la LCST hasta que la capa de polímero o copolímero se vuelve hidrófita. Las células se desprenden del sustrato y pueden retirarse en forma de una lámina. No se requiere la aplicación de métodos enzimáticos o mecánicos de separación celular.

La fase de cultivo celular va precedida por la preparación de la superficie relacionada con la modificación del sustrato de base seguido por la unión de la capa de polímero termosensible.

Las superficies de los materiales usados como sustratos de base pueden modificarse con métodos químicos y fisicoquímicos dirigidos a producir cambios estructurales en la superficie o cambios en la humectabilidad de la superficie. Tales materiales se usan entonces como sustratos de base que van a combinarse con un polímero termosensible. Con el fin de hacer esto, se aplican comúnmente injerto por radiación o fotoinjerto y conducen a la formación de enlaces químicos entre el sustrato de base y el polímero.

Con referencia a los sustratos de base usados en cultivos celulares, los documentos de patente (por ejemplo, documentos JP 6104061 o JP5192130 y otros) comentan sustratos que pueden prepararse de cualquier tipo de polímero (incluyendo polietileno, polipropileno, poli(tereftalato de etileno), poli(tetrafluoroetileno), poliestireno y poli(metacrilato de metilo)), materiales cerámicos, metales inertes y vidrio. La forma y el tipo de sustrato no están limitados, pero se usan habitualmente placas, platos o frascos para cultivo celular.

La bibliografía científica y de patentes indica que se usa principalmente poliestireno modificado (TCPS - poliestireno para cultivo tisular) como sustrato de base. En otras publicaciones de patente (documento JP 2006008975 (A)), además de poliestireno, sólo se han descrito superficies de poli(tereftalato de etileno) poroso y vidrio modificadas mediante el uso de un agente de acoplamiento para aplicaciones en cultivo celular. El injerto de polímeros incluyendo poM(N-isopropilacrilamida) sobre un sustrato de este tipo se ha realizado en presencia de un iniciador de radicales.

Un sustrato para cultivo celular, cuya superficie está cubierta con un polímero o copolímero termosensible que puede alterar de manera reversible sus propiedades de hidrófilas a hidrófobas con los cambios en la temperatura, es

el objeto de la patente EP0382214 (B1). Se unió una capa de poll(N-lsoprop¡lacrilam¡da) o poli(N,N-dietilacrilamida) en una placa de Petrl de poliestireno durante el Injerto con Irradiación con haz de electrones. Se cultivaron células de tejido endotellal sobre el sustrato en un medio de cultivo celular a una temperatura de 37°C y en presencia de un 5% de CO2. Tras la proliferación, la temperatura de cultivo se redujo desde 37°C hasta 4°C, y se observó una separación de las células.

Un método de cultivo de células cutáneas y preparación del sustrato fue también el objeto de la solicitud de patente JP5192138 (A) en el que se injertó N-isopropilacrilamlda disuelta en alcohol ¡soproplllco sobre una placa de Petri mediante Irradiación con haz de electrones. El cultivo de queratlnocltos se realizó sobre la placa, esterilizada con óxido de etlleno, según el método y las condiciones descritos anteriormente.

Cuestiones relacionadas con el cultivo celular, Incluyendo muchos tipos de células en una capa y sustratos con al menos un polímero termosensible, fueron el objeto de otras Invenciones notificadas (por ejemplo, documento WO2010010837 (A1)) en las que se usan dos o más polímeros Injertados sobre un sustrato de base en diferentes zonas para el cultivo celular. Según el documento EP1264877A1, el cultivo celular se realiza sobre el sustrato cubierto con una capa de polímeros con diferentes afinidades por el agua. El sustrato de base puede no sólo ser poliestireno y poll(metacrllato de metilo), sino que también puede Incluir otros materiales tales como materiales cerámicos y metales. Cuestiones similares son el objeto de las solicitudes de patente WO2010044417 (A1) y EP2348099 (A1).

En la solicitud EP0470681 (A1), se presentan una descripción y cuestiones referentes al cultivo de muchos tipos de células en agrupaciones de tamaño controlable. La Invención US20080009063A1 se refiere al cultivo celular sobre un sustrato cuya superficie está conformada con numerosos cráteres que forman diversos patrones cubiertos con al menos un polímero termosensible. También pueden cultivarse células epidérmicas, según notifica la Invención W00210349 (A1), sobre un sustrato cubierto con una o muchas capas de un polímero termosensible, y la separación de las células del sustrato es posible con el uso de una membrana de polímero.

Una estructura de múltiples capas del sustrato de cultivo celular, el método para su preparación y las células cultivadas sobre el mismo son el objeto de la invención notificada W02010047171 (A1). Un sustrato de base de poliestireno cubierto con un polímero termosensible (poll(N-lsopropilacrilamida)) e injertado mediante radiación con haz de electrones constituye las capas de sustrato. Entonces se sililó la capa de polímero termosensible y se cubrió con polietilenglicol antiadhesivo o bien sobre toda la superficie o bien en zonas seleccionadas.

En ejemplos descritos en la bibliografía científica y de patentes y en los ejemplos mencionados anteriormente, la capa de polímero de un sustrato de cultivo... [Seguir leyendo]

Método para preparar un sustrato con una capa de polímero termosensible de afinidad por el agua que puede cambiar (LCST) dentro de 0-80°C, en el que:

i. se limpia un sustrato de base de silicio o vidrio no orgánico y se modifica con grupos funcionales reactivos y entonces

ii. se inmoviliza un polímero termosensible mediante injerto de cadenas y formación de enlaces covalentes en una atmósfera protectora de argón y en una disolución,

caracterizado porque la inmovilización del polímero termosensible se realiza a partir de una disolución de homo y copolímeros vivos de 2-oxazolina 2-sustituida, donde se crean enlaces covalentes en la reacción entre:

los grupos de terminación nucleófilos del sustrato de base obtenidos como resultado de la modificación del sustrato y

el centro de propagación catiónico en el extremo de la cadena de los polímeros a partir de un grupo de 2-oxazolina 2-sustituida.

Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmovilización se realiza hasta que se forma una capa de polímero con una conformación en cepillo y una densidad de injerto de polímero de 0,1-1,8 cadenas/nm2 sobre el sustrato de base.

Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por la selección de un grupo de terminación nucleófilo de un grupo que incluye grupos amlno y sus derivados, grupos hidroxilo y sus derivados, y grupos tiol y sus derivados.

Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por la selección de un grupo de iniciación catiónico de un grupo que incluye ácido p-toluenosulfónico y sus derivados con ásteres, ácido trifluorometanosulfónico y sus derivados con ásteres, haluros de alquilo, haluros de bencilo, fluoruros de antimonio y boro, ácido sulfúrico y sus ásteres, ácido clorhídrico, ácido peryódico y perclórico y sus sales, cloroformiatos, y ácido tricloroacético y sus derivados.

Método para producir el sustrato con una capa de polímero termosensible de afinidad por el agua que puede cambiar (LCST) dentro de 0-80°C, en el que:

i. se limpia un sustrato de base de silicio o vidrio no orgánico y se modifica con grupos funcionales reactivos y entonces

ii. se inmoviliza un polímero termosensible mediante injerto de cadenas con la formación de enlaces covalentes bajo una atmósfera protectora de argón y en una disolución,

caracterizado porque la inmovilización de los polímeros termosensibles a partir de un grupo de homo y copolímeros de 2-oxazolina 2-sustituida se realiza en una disolución, donde se crean enlaces covalentes durante la polimerización de un monómero a partir de un grupo de 2-oxazolina 2-sustituida tal como se describe mediante la fórmula (1) iniciada por un iniciador de la polimerización catiónica presente sobre el sustrato de base que es un resultado de la modificación del sustrato,

HjC-----CH2

l l

N

R

O

(1)

R representa un grupo alquilo C2-Cg.

Método según la reivindicación 5, caracterizado porque la inmovilización se realiza hasta que se forma una capa de polímero con una conformación en cepillo y una densidad de injerto de polímero de 0,1-1,8 cadenas/nm2 sobre el sustrato de base.

Método según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el iniciador de la polimerización catiónica se selecciona de un grupo que incluye ácido p-toluenosulfónico y sus derivados con ásteres, ácido trifluorometanosulfónico y sus derivados con ásteres, haluros de alquilo, haluros de bencilo, cloroformiatos,

y ácido tricloroacético y sus derivados.

Método según las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el contenido de grupos de iniciación en relación con al menos un monómero del grupo de 2-oxazolina 2-sustituida asciende a desde el 10,0 hasta el 0,08 por ciento en moles.

Sustrato que consiste en un sustrato de base de silicio o vidrio no orgánico modificado mediante la unión covalente de un grupo de unión de sililo a través de un grupo funcional con una capa de polímero inmovilizada sobre el sustrato durante el injerto de las cadenas de polímero o copolímero termosensible, caracterizado porque la capa de polímero es de conformación en cepillo de polímero y se representa por un polímero o copolímero a partir de un grupo de 2-oxazolina 2-sustituida, y la densidad de las cadenas conectadas al grupo funcional del grupo de unión de sililo es de 0,1-1,8 cadenas/nm2

Sustrato según la reivindicación 9, caracterizado por una capa de polímero que está unida covalentemente al grupo funcional de un grupo de unión de sililo mediante el elemento facilitado en la fórmula (2),

XCH2-CH2-N

I

0<>Cv'R

(2)

X representa un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno o azufre del grupo de unión de sililo, mientras que R representa un grupo alquilo C2-C9 del monómero de 2-oxazolina 2-sustituida.

Sustrato según la reivindicación 9, caracterizado por una capa de polímero que está unida covalentemente al grupo funcional de un grupo de unión de sililo mediante el elemento mostrado en la fórmula (3),

Y-N-CH2-CH2-

(3)

Y representa el grupo alquilo del grupo de unión de sililo de una cadena lineal o ramificada, mientras que R representa un grupo alquilo C2-C9 del monómero de 2-oxazolina 2-sustituida.

Aplicación del sustrato con una capa de polímero termosensible hecha de homo y copolímeros a partir de un grupo de 2-oxazolina 2-sustituida según las reivindicaciones 9 a 11, u obtenida mediante el método definido en las reivindicaciones 1 a 8, para cultivos celulares, particularmente células cutáneas.