Método para distinguir gránulos secretores de distintas edades.

Un método in vitro de detectar gránulos secretores (GS) de diferentes edades en una célula marcando diferencialmente dichos GS según su edad que comprende:

(a) poner en contacto una célula que puede formar GS y que expresa una proteína de fusión que comprende

(i) un (poli)péptido específico para GS y

(ii) un (poli)péptido que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde el (poli)péptido es un SANP-tag, un HaloTag o una etiqueta de tetracisteína In-Cell;

en donde dichas sustancias son capaces de penetrar la membrana celular y en donde al menos las sustancias A y C son detectables por medios diferentes;

con la sustancia A dirigiéndose a dicho sitio de unión;

(b) saturar dichos sitios de unión poniendo en contacto la célula con una sustancia B que bloquea los sitios de unión que no se unieron a la sustancia A;

(c) permitir que la sustancia B sin unir se elimine de la célula o eliminar la sustancia B sin unir de la célula;

(d) poner en contacto la célula con una sustancia C que se dirige a dicho sitio de unión en la proteína de fusión que se vuelve disponible para la unión después del paso (b); y

(e) detectar la presencia de ambas sustancias detectables A y C;

en donde la detección simultánea de ambas sustancias A y C es indicativa de la presencia de dos poblaciones de GS que tienen diferente edad.

Método para distinguir gránulos secretores de distintas edades

La presente invención se refiere a un método in vitro para detectar gránulos secretores (GS) de diferente edad en una célula marcando diferencialmente dichos GS según su edad, como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas, que comprende (a) poner en contacto una célula que puede formar GS y que expresa una proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido específico para GS y (¡i) un (poli)péptido que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde dichas sustancias son capaces de penetrar la membrana celular y en donde al menos las sustancias A y C son detectables por medios diferentes con una sustancia A que se dirige a dicho sitio de unión, (b) saturar dichos sitios de unión poniendo en contacto la célula con una sustancia B que bloquea los sitios de unión que no estaban unidos a la sustancia A, (c) permitir que la sustancia B sin unir se elimine de la célula o eliminar la sustancia B sin unir de la célula, (d) poner en contacto la células con una sustancia C que se dirige al dicho sitio de unión en la proteína de fusión que se vuelve disponible para la unión después del paso (b) y (e) detectar la presencia de ambas sustancia detectables A y C, en donde la detección simultánea de ambas sustancias A y C es indicativa de la presencia de poblaciones de GS que tienen una edad diferente. Además, la presente invención se refiere a un método in vitro de investigar en una célula el efecto de un estímulo sobre gránulos secretores (GS) marcados diferencialmente según su edad.

En esta especificación, se citan un número de documentos incluyendo solicitudes de patente y manuales de fabricantes. La divulgación de estos documentos, mientras que no se considera relevante para la patentabilidad de esta Invención, se Incorpora al presente documento mediante referencia en su totalidad. Más específicamente, todos los documentos referenclados se Incorporan mediante referencia al mismo grado que si cada documento individual se Indicara especifica e Individualmente que se incorpora mediante referencia.

Los gránulos secretores (GS) son los orgánulos dedicados al almacenamiento de hormonas peptídicas en células endocrinas secretoras de péptldos. Los estímulos químicos indicen la fusión de los GS con la membrana plasmática y la liberación de su contenido en el espacio extracelular. Como la mayoría de las proteínas secretoras, las hormonas peptídicas se translocan cotraduccionalmente a la luz del retículo endoplásmico rugoso, después se transportan al complejo de Golgi y por último se separan en GS nacientes. A lo largo de esta ruta las hormonas peptídicas pueden sufrir múltiples modificaciones postraduccionales, incluyendo corte proteolítico y glicosilación. Por tanto, la generación de GS es un proceso lento, que requiere más de 3 minutos. Como la estimulación sostenida produce una disminución progresiva de GS, las células deben activar rápidamente los mecanismos traduccionales y postraduccionales para renovar su conjunto de estos orgánulos.

Desde su descubrimiento por microscopía electrónica hace más de cincuenta años los gránulos secretores (GS, también conocidos como vesículas de núcleo denso grande) de las células neuroendocrinas han atraído la atención de los biólogos celulares. Esto es debido a que son los orgánulos neuroendocrinos predominantes, tienen un contenido denso a los electrones, y son responsables de la liberación regulada de hormonas peptídicas y neuropéptidos. Los GS son orgánulos esféricos encerrados por membrana con el diámetro de varios cientos de nm. Cuando los gránulos se originan en la red del trans-Golgi (TGN) aún son inmaduros. El procesamiento y empaquetamiento progresivo de cargas de péptidos produce la condensación creciente de su núcleo electrodenso y su conversión de GS maduros (Glombik y Gerdes, 2). Los GS típicamente se distinguen en base a su aspecto morfológico y alta inmunorreactividad para hormonas peptídicas específicas de tipo celular y otras cargas más amplias, incluyendo cromogranina A (CgA), B (CgB) y secretograninas ll-IV (Taupenot et al., 23), así como enzimas de procesamiento de prohormonas, incluyendo prohormona convertasas 1/3 (PC 1/3) y 2 (PC2) y carboxipeptidasa E/H (CPE) (Steiner, 1998). Como se ha propuesto recientemente (Meldolesi et al., 24), los criterios adicionales mínimos para reconocer SG maduros auténticos también deben comprender su almacenamiento prolongado en células en reposo; la inclusión de proteínas v-SNARE específicas que son esenciales para la fusión regulada de GS con la membrana plasmática, y la falta de marcadores endosómicos o lisosómicos. A pesar de sus propiedades distintivas de otros orgánulos, los GS son una población vesicular heterogénea incluso en un tipo de células individual. Por ejemplo, se pueden diferenciar en tamaño y cinética de liberación de contenido (Perrais et al., 24; Grabner et al., 25; Michael et al., 26). Algunas de estas diferencias pueden depender del envejecimiento de los GS, ya que la condensación del contenido puede reducir progresivamente el tamaño del gránulo y la velocidad con la que las cargas se disuelven en el espacio extracelular. El envejecimiento también puede afectar la probabilidad de que los GS secretores experimenten exocitosis, siendo los GS recién generados preferentemente liberados (Duncan et al., 23; Solimena y Gerdes, 23). Un vez que un GS maduro se forma, retiene su identidad a lo largo del ciclo exoendocítico. Después de la exocitosis, en particular, las membranas de los GS se recapturan principalmente intactas (Taraska et al., 23), aunque algunas proteínas transmembrana como sinaptotagmina-1 y la V-SNARE VAMP2/sinaptobrevina2 pueden difundir de sitios de exocitosis (Tsuboi et al., 24), mientras que la cola citosólica de ICA512/IA-2 se puede salvar (Borgonovo et al., 26).

Duncan et al. (23) encontraron que los gránulos están espacial y funcionalmente segregados según su edad. Sin embargo, hasta ahora, no se conoce método viable, fiable y rápido para distinguir GS de diferentes edades. Tal

método sería muy ventajoso, por ejemplo, para examinar adicionalmente la función de los GS y para proporcionar métodos para cribar compuestos potencialmente útiles para tratar enfermedades asociadas con defectos en la síntesis y/o secreción de GS.

Roberti etal. 27 (Nature Methods, 4:345-351) describe imagenología fluorescente de los procesos dinámicos que producen depósitos amiloides en células vivas empleando una proteína de fusión de a-sinucleína y una etiqueta de tetracisteína como diana para compuestos biarsénicos fluorogénicos.

Adams et al. 22 (Am. Chem. Soc., 124:663-676) describe ligando biarsénicos y motivos tetracisteína para el mareaje de proteínas in vitro e in vivo así como un huésped, es decir, células HeLa, que expresa una proteína de fusión de sinaptobrevina y una etiqueta de tetracisteína.

La solución a este problema técnico se logra proporcionando las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Según esto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro de detectar gránulos secretores (GS) de diferentes edades en una célula marcando diferencialmente dichos GS según su edad, como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas, que comprende (a) poner en contacto una célula que puede formar GS y que expresa una proteína de fusión que comprende (i) un (poli)péptido específico para GS y (ii) un (poli)péptido que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde dichas sustancias son capaces de penetrar la membrana celular y en donde al menos las sustancias A y C son detectables por medios diferentes con una sustancia A que se dirige a dicho sitio de unión, (b) saturar dichos sitios de unión poniendo en contacto la célula con una sustancia B que bloquea los sitios de unión que no estaban unidos a la sustancia A, (c) permitir que la sustancia B sin unir se elimine de la célula o eliminar la sustancia B sin unir de la célula, (d) poner en contacto la células con una sustancia C que se dirige al dicho sitio de unión en la proteína de fusión que se vuelve disponible para la unión después del paso (b) y (e) detectar la presencia de ambas sustancia detectables A y C, en donde la detección simultánea de ambas sustancias A y C es indicativa de la presencia de poblaciones de GS que tienen una edad diferente.

El término marcar diferencialmente dichos GS según su edad como se usa en la presente invención significa que las poblaciones de GS que tienen una edad diferente se pueden marcar dependiendo... [Seguir leyendo]

Un método ¡n vitro de detectar gránulos secretores (GS) de diferentes edades en una célula marcando diferencialmente dichos GS según su edad que comprende:

(a) poner en contacto una célula que puede formar GS y que expresa una proteína de fusión que comprende

(i) un (poli)péptido específico para GS y

(¡I) un (poli)péptldo que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde el (poll)péptido es un SANP-tag, un HaloTag o una etiqueta de tetraclsteína In-Cell;

en donde dichas sustancias son capaces de penetrar la membrana celular y en donde al menos las sustancias A y C son detectables por medios diferentes; con la sustancia A dirigiéndose a dicho sitio de unión;

(b) saturar dichos sitios de unión poniendo en contacto la célula con una sustancia B que bloquea los sitios de unión que no se unieron a la sustancia A;

(c) permitir que la sustancia B sin unir se elimine de la célula o eliminar la sustancia B sin unir de la célula;

(d) poner en contacto la célula con una sustancia C que se dirige a dicho sitio de unión en la proteína de fusión que se vuelve disponible para la unión después del paso (b); y

(e) detectar la presencia de ambas sustancias detectables A y C;

en donde la detección simultánea de ambas sustancias A y C es Indicativa de la presencia de dos poblaciones de GS que tienen diferente edad.

Un método ¡n vitro de Investigar en una célula el efecto de un estímulo en gránulos secretores (GS) dlferenclalmente marcados según su edad que comprende:

(a) poner en contacto una célula que puede formar GS y que expresa una proteína de fusión que comprende

(i) un (poli)péptldo específico para GS y

(¡i) un (poli)péptldo que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde el (poli)péptldo es un SANP-tag, un HaloTag o una etiqueta de tetraclsteína In-Cell;

en donde dichas sustancias son capaces de penetrar la membrana celular y en donde al menos las sustancias A y C son detectables por medios diferentes; con

a. una sustancia A que se dirige a dicho sitio de unión; y saturar los sitios de unión restantes poniendo en contacto la célula con una sustancia B que bloquea los sitios de unión que no se

unieron a la sustancia A; o

b. una sustancia B que bloquea dicho sitio de unión en una cantidad suficiente para saturar dichos

sitios de unión

(b) permitir que la sustancia B sin unir se elimine de la célula o eliminar la sustancia B sin unir de la célula; (c1) aplicar un estímulo a la célula;

(d1) poner en contacto la célula con una sustancia C que se dirige a dicho sitio de unión en la proteína de fusión expresada durante y/o después del paso (c); y

(e1) detectar la presencia de la sustancia A y/o C y/o monitorizar el número, tamaño, motilidad, localización en la célula, y/o secreción de los GS dlferenclalmente marcados obtenidos en el paso (a) y/o (d1); o (c2) poner en contacto la célula con una sustancia C que se dirige a dicho sitio de unión en la proteína de fusión expresada durante y/o después del paso (c);

(d2) aplicar un estímulo a la célula; y

(e2) detectar la presencia de la sustancia C y/o monitorizar el número, tamaño, motilidad, localización en la célula, y/o secreción de los GS dlferenclalmente marcados obtenidos en el paso (a) y/o (c2).

Un huésped transgénico no humano que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende

(i) un (poll)péptido específico para GS, en donde el (poli)péptido específico para GS es insulina, fogrina, ICA512, carboxipeptidasa E/H, cromogranina A, cromogranina B, secretogranina II, proteína convertasa 1 o 2, amilina, hormona de crecimiento, prolactina, ANP o NPY y

(ii) un (poli)péptido que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde el (poli)péptido es un SANP-tag, un HaloTag o una etiqueta de tetraclsteína In-Cell.

El método de la reivindicación 2, en donde el estímulo es un agente de prueba y el efecto que se va a investigar es la capacidad del agente de prueba de inducir la formación de gránulos secretores o su secreción o ambos (GS) en una célula;

en donde el método comprende además el paso (f) comparar los resultados obtenidos en el paso (e1) o (e2) con los obtenidos para una célula de referencia que no se ha puesto en contacto con el agente de prueba pero se ha tratado de otra manera igualmente;

en donde una cantidad de sustancia A y/o sustancia C detectada en la célula que es diferente de esa en la célula de referencia es indicativa de la capacidad del agente de prueba de afectar la formación y/o la secreción de GS en la célula.

5. El método o el huésped transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el GS es un gránulo de insulina y el (poli)péptido del paso (a) (I) es específico para gránulos de Insulina.

6. El método o el huésped transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la sustancia B que se une a SANP-tag es BTP.

7. El método o el huésped transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la sustancia A que se une a SANP-tag es TMR-Star, BG-55, BG-43 o BG-DAF.

8. El método o el huésped transgénico no humano de la reivindicación 7, en donde la sustancia C que se une a SANP-tag es TMR-Star, BG-55, BG-43 o BG-DAF.

9. El método de cualquiera de la reivindicaciones 2 y 4 a 8, en donde el estímulo es una sustancia química o radiación.

1. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 9, en donde la detección o monltorlzación se efectúa detectando emisión de fluorescencia después de la excitación a una longitud de onda apropiada, qulmlolumlnlscencla o absorbancla de luz.

11. El método o el huésped transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en donde la proteína de fusión se expresa después de introducir un ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión en la célula.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde el (poli)péptido es insulina, fogrina, ICA512, carboxipeptidasa E/H, cromogranina A, cromogranina B, secretogranina II, proteína convertasa 1 o 2, amilina, u otra hormona endocrina neuropéptido específico para GStal como hormona de crecimiento, prolactina, ANP

y NPY.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 12, en donde la sustancia A o C o ambas

comprenden 1. una fracción que se une específicamente al sitio de unión en la proteína de fusión y 2. una

fracción detectable.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 13, que comprende además poner en contacto la

célula con una sustancia D que se dirige a dicho sitio de unión en la proteína de fusión que se vuelve

disponible para unión después del paso (d) y después de permitir que la sustancia C sin unir se elimine de la célula o después de eliminar la sustancia C sin unir de la célula.

15. Un método para detectar una sustancia secretada de GS marcados uniforme o diferencialmente según su edad que comprende

(a) separar una célula capaz de formar GS, que expresa una proteína de fusión que comprende

(i) un (poli)péptido específico para GS; y

(ii) un (poli)péptido que tiene un sitio de unión común para al menos tres sustancias diferentes A, B y C que se unen covalentemente al mismo, en donde el (poli)péptido es un SANP-tag, un HaloTag o una etiqueta de tetracisteína In-Cell y en donde dichas sustancias son capaces de penetrar la membrana celular y en donde al menos las sustancias A y C son detectables por medios diferentes

y

(I) tratada según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5 a 14; de su medio de cultivo; y

(b) detectar en el medio la presencia de cualquier sustancia detectable aplicada pata el mareaje de GS, si hay alguna;

en donde la detección de una o más sustancias en el medio indica que la secreción desde los GS ha tenido lugar.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 a 14, que comprende además poner en contacto la célula que se va a someter al paso (a) con una sustancia B que bloquea los sitios de unión en dicho (poli)péptido ya expresado en la célula y permitir que la sustancia B sin unir se elimine de la célula o eliminar la sustancia B sin uniir de la célula.