Método para dectectar inserciones de espaciadores en estructuras CRISPR.

La presente invención se refiere a un método para detectar inserciones de espaciadores mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR) que comprende la inserción de al menos una unidad CRISPR-espaciador,

en la estructura artificial dentro de la secuencia que codifica un gen testigo, que restaura la pauta de lectura de traducción, donde la expresión del gen testigo es indicativo de la inserción del espaciador. También se refiera a la estructura artificial utilizada.

MÉTODO PARA DETECTAR INSERCIONES DE ESPACIADORES EN ESTRUCTURAS CRISPR

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en general en el campo de la genética y en 5 particular se refiere a un método para detectar inserciones de espaciadores mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en CRISPR.

Estado de la técnica

Los sistemas CRISPR-Cas se han identificado en la mayoría de las arqueas y 10 aproximadamente la mitad de los genomas de bacterias. Cada sistema está constituido por una o varias agrupaciones de repeticiones de ADN denominadas CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y un conjunto de genes que codifican las proteínas Cas (CRISPR associated) funcionalmente relacionados con la actividad de las CRISPR. Dichas repeticiones se encuentran 15 regularmente espaciadas dentro de cada agrupación por secuencias no reiteradas denominadas espaciadores, al menos algunas de las cuales derivan de fragmentos localizados en elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y virus. Adyacente a cada agrupación de repeticiones-espaciadores hay una secuencia denominada líder donde se localiza el promotor responsable de la transcripción de dicha agrupación en 20 un RNA primario (pre-crRNA) que abarca la totalidad de la misma.

La identidad de los genes cas asociados a una agrupación CRISPR puede variar de manera considerable entre sistemas, en base a la cual los CRISPR-Cas se clasifican en 3 tipos principales, cada uno de los cuales incluye varios subtipos. Tan solo casi y cas2 están presentes en todos los subtipos identificados hasta la fecha.

Los sistemas CRISPR-Cas producen la degradación (interferencia) de ADN exógeno conteniendo secuencias complementarias a los espaciadores. Un sistema CRISPR- Cas activo puede insertar nuevos espaciadores (proceso conocido como adquisición y catalizado por Casi y Cas2) entre el líder y la repetición contigua. La inserción conlleva la duplicación de la repetición adyacente al sitio de inserción. La adquisición 30 de un nuevo espaciador proporciona inmunidad frente a moléculas conteniendo la secuencia de la cual deriva. Para ello, en un primer paso del proceso de interferencia los pre-crRNAs son procesados dando lugar a moléculas crRNA conteniendo un único

espaciador. Cada uno de estos crRNAs aparea con su secuencia complementaria en una molécula de ADN reclutando a continuación proteínas Cas específicas que producen su degradación. Además de una función como sistema inmune, se ha propuesto una implicación de los CRISPR-Cas en regulación génica y reparación de ácidos nucleicos.

La inserción de nuevas unidades CRISPR-espaciador es un evento poco frecuente y cuya detección requiere realizar un escrutinio al azar de las agrupaciones CRISPR de un gran número de clones (por ejemplo mediante amplificación por PCR). Tan solo cuando dicha adquisición produzca un nuevo patrón de interferencia se podrían seleccionar las células adaptadas, requiriendo para ello condiciones experimentales que permitan dicha interferencia y excluyendo la detección de inserciones silenciosas.

La disponibilidad de una herramienta para detectar inserciones de espaciadores mediante una selección independiente de la interferencia resulta por tanto ventajosa respecto a sistemas no seleccionables.

Descripción de la invención

Así pues la presente invención en un primer aspecto se refiere a un método para detectar inserciones de espaciadores, de ahora en adelante método de la presente invención, mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR) que comprende la inserción de al menos una unidad CRISPR- espaciador, en la estructura artificial dentro de la secuencia que codifica un gen testigo, que restaura la pauta de lectura de traducción, donde la expresión del gen testigo es indicativo de la inserción del espaciador.

En una realización más en particular la unidad CRISPR-espaciador insertada comprende un número de nucleótidos no múltiplo de 3.

En una realización más en particular, el espaciador de la unidad CRISPR-espaciador del método de la presente invención comprende un codón de terminación. Más en particular el codón de terminación es críptico.

En una realización más en particular, la estructura artificial del método de la presente invención comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103, en una realización más en particular, la estructura artificial del método de la presente

invención se corresponde con la fusión traduccional de un cassette CRISPR- espaciador-CRISPR-líder y la secuencia codificante del gen de la cloranfenicol acetil-transferasa (caí), donde los nucleótidos del 96-124 y 156-165 se corresponden con las unidades CRISPR y la región líder (nucleótidos 165-234) del cassette insertado 5 de la región codificante de la proteína CAT (nucleótidos 275-953) que se encuentra fuera de fase respecto al inicio de la traducción.

En una realización más en particular de la presente invención, el espaciador es seleccionado de entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 89.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una estructura artificial, de ahora en adelante, estructura artificial de la presente invención) identificada caracterizada porque comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de la estructura artificial de la presente invención para la detección de inserciones de espaciadores.

Descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de la integración en los cassettes testigo clonados en los plásmidos pCSIR y la estrategia usada para detección específica de integración. A. Cassette de integración en pCSIR-A o pCSIR-T consta de un líder y dos duplicones CRISPR (CR) interespaciados por un espaciador (Sp-1) fusionado aguas arriba a un fragmento del gen of lacZ-a (lacZa) y, aguas abajo la secuencia completa del gen cat fuera de fase (cat +2). Se indican el punto de unión al ribosoma (rbs) y el codón de inicio de la traducción lacZ-a (punta de flecha blanca). La traducción de los transcritos generados desde el promotor tac (P,ac, representado con una flecha) termina en el líder (punta de flecha negra). Aguas abajo del gen cat se localiza un promotor de T7 (P-17), que inicia la transcripción en sentido opuesto (la flecha apunta en el sentido de la transcripción). Se muestran las secuencias de los fragmentos en la región líder-caí de pCSIR-T y pCSIR-A. Los nucleótidos idénticos a la variante de líder T o A correspondiente están sombreados, los codones de terminación y la caja -10 subrayados y etiquetados (el punto de inicio se indica con una flecha que apunta en la dirección de transcripción). Para evitar codones de terminación, se reemplazaron las timinas en las posiciones 42 y 70 del líder de pCSIR-T por citosina y adenina respectivamente (ver el cebador TLR en la Tabla 2). La traducción del

transcrito generado de Ptac acaba en el líder en caso de deleclón (caí seguiría fuera de fase, caf+1) (B), en el espaciador duplicado (Sp-1) en caso de duplicación CRISPR-espaciador (C), o en el codón de terminación de la secuencia codificante de cat en el caso de la inserción (D) de un espaciador nuevo (Sp-2).

Figura 2: Distribución, en pCas1-2[K], de las secuencias correspondientes a espaciadores muestreados en los ensayos de adquisición. Los espaciadores se muestran como flechas negras apuntando al líder tal y como se insertaron en el cassette de integración. Se muestra el origen de replicación (CDF ori), los genes codificando el represor del operón lac (Lacl), la proteína de resistencia a estreptomicina (SmR), y el promotor T7-lac (Pj7) que promueve la transcripción de la variante K de los genes cas1-2 (casi-K y cas2-K).

Figura 3: WebLogos generados por el alineamiento de las regiones de protoespaciadores de CRISPR2 de E. coli. Las secuencias conteniendo protoespaciadores (posiciones -1 a -33) y los dos nucleótidos adyacentes de la región PAM (posiciones 0 y 1) estaban orientados del mismo modo que los espaciadores correspondientes en la agrupación CRISPR (el extremo 3 hacia el líder). Los logos se obtuvieron a partir de secuencias no CRISPR con una identidad mayor al 90% a espaciadores de genomas de E. coli, asociados con el líder-T (A) o el líder-A (B), así como protoespaciadores correspondientes a espaciadores encontrados en los experimentos de adquisición realizados en cepas alojando los genes Cas-EK (C) o Cas-EO (D).

Figura 4: Mecanismo hipotético de... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar inserciones de espaciadores mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR) que

comprende la inserción de al menos una unidad CRISPR-espaciador, en la estructura artificial dentro de la secuencia que codifica un gen testigo, que restaura la pauta de lectura de traducción, donde la expresión del gen testigo es indicativo de la inserción del espaciador.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la unidad CRISPR- 10 espaciador insertada comprende un número de nucleótidos no múltiplo de 3.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el espaciador comprende un codón de terminación críptico.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la estructura artificial comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que

el espaciador es seleccionado de entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 89.

6. Estructura artificial identificada caracterizada por que comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103.

7. Uso de la estructura artificial según la reivindicación 6 para la detección de

inserciones de espaciadores.