Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática.

La presente invención describe un método de diagnóstico de la fibrosis hepática, que comprende detectar el nivel de expresión del gen GATA-4, o la cantidad de la proteína GATA-4, en la muestra biológica aislada de tejido hepático, y kit de diagnóstico.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico temprano de la fibrosis hepática, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuantitativo) específico, que se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad hepática crónica es actualmente una causa principal de hospitalización y mortalidad, especialmente en los pacientes que presentan coinfección por VIH y VHC o VHB. La incidencia de la enfermedad hepática continúa en crecimiento.

La fibrosis hepática es una respuesta fisiopatológica a daños crónicos producidos principalmente por el consumo abusivo de alcohol, infección vírica u obstrucción del conducto biliar. En el proceso fibrótico se produce la acumulación de componentes de matrix extracelular, tales como el colagéno y la laminina. El contenido en componentes de matrix extracelular está controlado por múltiples mecanismos moleculares y celulares, entre los que se incluyen la proliferación y activación de células productoras de colágeno. La mayor fuente de células productoras de colágeno y otros componentes de la matrix extracelular son las células estrelladas del hígado (Hepatic Stellate Cells, HSCs). En condiciones normales, las HSCs están en estado quiescente y almacenan vitamina A. Tras el daño hepático, estas células responden activándose y adquiriendo un forma miofibroblástica, entran en ciclo celular y comienzan a secretar componentes de matrix extracelular. La deposición de fibras de colágeno contribuye a formar cicatrices que desorganizan la estructura hepática afectando, por tanto, la función metabólica de los hepatocitos. La fibrosis hepática puede revertir si el agente causante del daño desaparece. En este caso, se desencadena un mecanismo de regeneración hepática, entre el que se incluye la reversión al estado inactivo de las HSCs y la replicación de los hepatocitos que reemplazan la pérdida de tejido hepático funcional. Sin embargo, si el daño hepático se mantiene, la progresión de la fibrosis hepática conlleva un estadio irreversible, conocido como cirrosis, en el que la excesiva acumulación

de componentes de la matriz extracelular distorsiona la arquitectura hepática y el hígado es incapaz de responder a las demandas metabólicas del organismo.

La fibrosis, por tanto, es un fenómeno frecuente en las enfermedades hepáticas y aunque inespecífica su exacta caracterización ayuda al diagnóstico. Su valoración incluye definir su ubicación, su distribución y su intensidad. La ubicación puede ser portal, periportal, intraacinar, zonal, sinusoidal, en puentes, o perinodular. En cuanto a la distribución, hay focal, difusa, lobar y segmentaria. La intensidad se gradúa en leve, moderada, intensa o acentuada, y cirrótica.

El diagnóstico preciso del grado la fibrosis resulta necesario para determinar la progresión de la enfermedad hepática, efectuar un pronóstico y tomar decisiones terapéuticas.

Actualmente, la biopsia hepática es el método de referencia para determinar el grado de fibrosis hepática y ha sido recomendada extensamente para evaluar la necesidad de tratar a los pacientes con uno u otro tratamiento. No obstante, se han desarrollado procedimientos no invasivos para determinar los diferentes estadios de fibrosis hepática, que podemos dividir en dos categorías: los métodos de imagen, como la elastometría transitoria, y las pruebas basadas en la determinación sérica de marcadores biológicos.

Así, el Fibrotest es un índice que se calcula combinando 5 marcadores bioquímicos indirectos de fibrosis ajustados a la edad y el sexo. Estos marcadores se asocian con activación de las HSCs. Las HSCs son las principales células fibrogénicas del hígado. Actualmente las principales estrategias terapéuticas para prevenir o revertir la fibrosis hepática se basan en inhibir la activación o proliferación de las HSCs, o bien en inducir la apoptosis de las células activadas. El test APRI hace referencia al índice de la relación de la aspartato aminotransferasa (AST) y de las plaquetas. Está basado en el hecho que la fibrosis progresiva se asocia con disminución de la eliminación de AST y trombocitopenia. El FIB-4 es un índice sencillo que incluye la edad, los niveles de AST, de alaninoaminotransferasa (ALT), y el recuento plaquetario. El HGM1 y el HGM2, son dos simples índices de diagnostico de la fibrosis hepática, basados en datos de laboratorio de rutina. El HGM-1 se basa en el recuento plaquetario, cifras de AST, y glucosa sérica en ayunas. El HGM-2 se basa en el recuento plaquetario, el índice INR, la fosfatasa alcalina (FA) y la AST.

Existen también una serie de marcadores séricos directos, como son el ácido hialuronico (zAH), el colágeno tipo IV, el propétido de procolágeno III N-terminal provol (PIIINP), las metaloproteinasas de matriz (MPM) (enzimas proteoliticas secretadas por las HSCs que

intervienen en la destrucción de la matriz extracelular (MEC), los inhibidores tisulares de las metaloproteasas de matriz (ITMP), la laminina, o la glicoproteína 39 del cartílago humano (YKL-40).

El Grupo Europeo de Fibrosis Hepatica (ELF, por sus siglas en ingles) ha desarrollado un algoritmo utilizando la edad, los niveles sericos de zAH, del PIIINP y del ITMP-1. Otro modelo de medición de la fibrosis hepática es Hepascore, elaborado a partir de los niveles de 4 marcadores séricos: bilirrubina, gamma glutamil transpeptidasa (GGT), zAH y alfa 2- macroglobulina, teniendo en cuenta la edad y el sexo.

Actualmente también se diagnostica la fibrosis hepática mediante elastografía transitoria (Fibroscan®). Consiste en una nueva técnica diagnóstica de la fibrosis hepática que utiliza una sonda que emite y recibe ondas de ultrasonidos. La velocidad de transmisión de estos ultrasonidos a través de un medio especifico varia con la densidad y la elasticidad de dicho medio. Mediante una ecuación física, se puede informatizar la elasticidad hepática basándose en la velocidad de la transmisión, de tal manera que cuanto mayor es la velocidad, menor la elasticidad y mayor la rigidez del hígado (fibrosis), cualidad opuesta a la elasticidad

Actualmente la biopsia hepática es la técnica diagnóstica de elección para determinar la presencia y estado de la fibrosis hepática. Existen varios sistemas para cuantificar el estadio de fibrosis hepática mediante análisis histológicos de tinción con hematoxilina eosina o con Sirius red para teñir las fibras de colágeno de las muestras de biopsias. El más utilizado es el METAVIR (METAVIR scoring system). METAVIR mide la fibrosis en una escala de 0-4, donde F0 corresponde a ausencia de fibrosis; F1, fibrosis portal sin septos; F2, fibrosis portal con algunos septos; F3, numerosos septos sin cirrosis; y F4, cirrosis. Se considera fibrosis significativa cuando el estadio de fibrosis es igual o superior a F2 y fibrosis avanzada, cuando se informa un estadio de fibrosis igual o superior a F3. La detección de pacientes en estadio F2 o superior conlleva importantes implicaciones clínicas pues, en la mayoría de los casos, se considera el umbral para iniciar el tratamiento. Además de los análisis histológicos, se hace necesaria la búsqueda de marcadores que confirmen la presencia del proceso fibrótico.

El factor de transcripción GATA-4 o GATA binding proteín 4 (también conocido como ASD2 y VSD1) es un miembro de la familia de factores de transcripción del tipo dedo de zinc que se expresa durante el desarrollo embrionario en diversos órganos como el corazón, el páncreas y el hígado, y su expresión continúa en estadíos adultos. Los miembros de esta

familia reconocen el motivo GATA, que está presente en los promotores de muchos genes.

Esta proteína se cree que regula los genes implicados en la embriogénesis y en la diferenciación y la función del miocardio. Las mutaciones en este gen se han asociado con defectos septales cardiacos. Este gen se localiza en el cromosoma 8 (8p23.1-p22) de humanos.

La detección de la presencia de fibrosis hepática y cuantificación de su magnitud son cruciales para tomar decisiones relacionadas con el manejo clínico de la enfermedad hepática. Puesto que los individuos que presentan una fibrosis leve o moderada son los que tienen mayor probabilidad de que el tratamiento sea más efectivo y de que la enfermedad se estabilice e incluso revierta, es necesario encontrar un... [Seguir leyendo]

1.- El uso del gen GATA-4, o de la proteína GATA-4, para el diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática.

2.- Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática, que comprende:

a. obtener una muestra biológica aislada que comprende células de un individuo, y

b. detectar el nivel de expresión del gen GATA-4, o la cantidad de la proteína GATA- 4, en la muestra aislada de (a), y

c. comparar la expresión del gen obtenida en el paso (b) con una cantidad de referencia.

3.- Un método para el diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática, que comprende los pasos (a) - (c) según la reivindicación 2, y además comprende:

(d) diagnosticar al individuo del paso (a) como un individuo con fibrosis hepática tipo I, cuando presente una expresión aumentada del gen GATA-4 o una cantidad mayor de la proteína GATA-4 en la muestra obtenida en (a), en relación a la cantidad de expresión detectada para dicho gen o dicha proteína en una población de pacientes (F0) de referencia.

4.- El método según la reivindicación 3, donde el individuo del paso (a) presenta un nivel de expresión del gen GATA-4 de un 110% con respecto a los niveles de expresión en una población de pacientes (F0) de referencia.

5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, que además comprende diagnosticar al individuo del paso (a) como un individuo con fibrosis portal con numerosos septos sin cirrosis (FII-FIN), cuando presenta un nivel de expresión del gen GATA-4 de entre un 15% y un 25% menos que en un individuo de referencia.

6.- El método según la reivindicación 5, donde el individuo del paso (a) presenta un nivel de expresión del gen GATA-4 de aproximadamente un 20% menos que en un individuo de referencia.

7.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, que además comprende diagnosticar al individuo del paso (a) como un individuo con cirrosis (FIV), cuando presenta

un nivel de expresión del gen GATA-4 de entre un 55% y un 65% menos que un individuo de referencia.

8.- El método según la reivindicación 7, donde el individuo del paso (a) presenta un nivel de expresión del gen GATA-4 de aproximadamente un 60% menos que en un individuo de

referencia.

9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-8, donde la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es una muestra de tejido hepático.

10.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, donde la detección de los niveles de expresión del gen GATA-4 se realiza mediante Q-RT-PCR.

11.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-10, donde la identificación de la

cantidad de proteína GATA-4, se realiza mediante técnicas inmmunológicas.

12.- El método según la reivindicación 11, donde las técnicas inmunológicas están basadas

en reacciones de precipitación, basadas en reacciones de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, ELISA (Enzime Linked

ImmunoadSorbent Assay), o en cualquiera de sus combinaciones.

13.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde las técnicas inmunológicas comprenden el inmunomarcaje.

14.- El método según la reivindicación 13, donde el inmunomarcaje se selecciona de entre inmunomarcaje con anticuerpos conjugados a enzimas, inmunomarcaje con anticuerpos

conjugados a fluorocromos, o citometría.

15.- Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para analizar el nivel de expresión del gen GATA-4 o la cantidad de proteína GATA-4.

16.- El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende un anticuerpo anti- GATA-4.

17.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, donde el anticuerpo

es monoclonal.

18.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde el anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo.

19.- El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, donde el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.

20.- El uso del kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 15-19, para el 5 diagnóstico diferencial de la fibrosis hepática, principalmente de fibrosis tipo I, de fibrosis tipo

ll-lll, y de cirrosis.