Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos.

Un método para cultivar eficientemente un adenovirus quimérico en una célula anfitrión seleccionada,

siendo dicho adenovirus quimérico procedente de una cepa de adenovirus parental incapaz de crecimiento eficiente en la citada célula anfitrión, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) generar un adenovirus quimérico que comprende:

(i) secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo y del extremo terminal derecho de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región de extremo izquierdo las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5', y comprendiendo dicha región de extremo derecho las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 3', y

(ii) las regiones internas de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5' y 3' naturales, comprendiendo dichas regiones internas los genes tardíos que codifican la penton, la hexon y la fibra;

en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5' hasta 3', una región terminal izquierda del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y la región terminal derecha del primer adenovirus, y

(b) cultivar dicho adenovirus quimérico en presencia de genes E1a, E1b y E4 ORF6 de adenovirus funcional procedentes del primer adenovirus o de un serotipo de adenovirus que transcomplementa el primer adenovirus, y además en presencia de genes estructurales adenovirales necesarios procedentes del extremo izquierdo del adenovirus.

Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos.

Antecedentes de la invención La presencia de inmunidad humoral (anticuerpos circulantes) respecto a proteínas de cápside de adenovirus es una barrera al uso de vectores de adenovirus para terapia de gen. Los vectores prototipo de adenovirus que han sido desarrollados para terapia de gen se basan en adenovirus del subgrupo C, como el serotipo 5. La prevalencia de anticuerpos neutralizantes frente a adenovirus del subgrupo C es generalmente alta en poblaciones humanas como resultado de una exposición frecuente a esos patógenos. Este hecho es probable que limite en gran medida la efectividad de los vectores de terapia de gen basados en serotipos tales como el Ad5.

El análisis de la naturaleza de los anticuerpos protectores frente a los adenovirus, ha indicado que el objetivo más importante es la hexon, la proteína de cápside principal [Wolfhart (1986) , J. Virol 62, 2321; Gall et al. (1986) , J. Virol. 70, 2116]. Se han realizado diversos esfuerzos para diseñar la hexon de modo que se puedan evadir los anticuerpos anti-hexon construyendo adenovirus quiméricos que acojan las hexones desde otros serotipos [Roy et al., (1998) , J. Virol. 72, 6875; Patente U.S. núm. 5.922.315; Gall et al., (1998) , J. Virol. 72, 10260; Youil et al., (2002) , Hum. Gene Ther. 13, 311; Wu et al., (2002) , J. Virol. 76, 12775]. Sin embargo, esto ha sido infructuoso en gran medida cuando se intentan intercambios entre serotipos distantes.

El documento WO 00/03029 describe métodos para generar adenovirus híbridos, por ejemplo para alterar la inmunogenicidad del adenovirus. En un ejemplo, un adenovirus quimérico tiene una proteína de fibra de un serotipo con una hexon o una penton o con otro serotipo.

Youil, Journal Virology, Hum. Gene Therapy, vol. 13, núm. 2 (20 de Enero de 2002) , describe intentos de realización de una diversidad de vectores basados en adenovirus-5 quiméricos. Mientras que fueron rescatables en cuatro vectores en los que los hexones de Ad1, Ad2, Ad6 o Ad12 están incorporados en el lugar del Ad5, los 14 intentos restantes para formar vectores adenovirales quiméricos a partir de los subgrupos A, B, C, D y E no tuvieron éxito.

Alternativamente, los investigadores han propuesto usar vectores de adenovirus que raramente causan infecciones humanas o hacen uso de adenovirus de fuentes no humanas. Sin embargo, la falta de una manera práctica en la que se produzcan grandes cantidades de tales vectores ha demostrado ser un obstáculo para el desarrollo de tales vectores.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un método de modificación de adenovirus que tienen cápsides, y en particular, que incluyen hexones, procedentes de serotipos que no están bien adaptados para su crecimiento en células para producción de virión adenoviral. El método es útil para la producción de cantidades escalables de adenovirus. Los genomas de adenovirus quiméricos resultantes son útiles para una diversidad de propósitos que se describen en la presente memoria.

Más en particular, la invención proporciona, en un aspecto, un método de cultivo eficiente de un adenovirus quimérico en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico procedente de una cepa de adenovirus parental incapaz de un crecimiento eficiente en dicha célula anfitrión, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) generar un adenovirus quimérico que comprenda: (i) secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo y del extremo terminal derecho de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región extrema izquierda repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5’, y comprendiendo dicha región extrema derecha repeticiones terminales invertidas (ITRs) 3’; y, (ii) las regiones internas forman un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones internas los genes tardíos que codifican la penton, la hexon, y la fibra, en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ hasta 3’, una región terminal izquierda del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y la región terminal derecha del primer adenovirus; y, (b) cultivar dicho adenovirus quimérico en presencia de genes ORF6 de los adenovirus funcionales de E1a, E1b y E4 a partir del primer adenovirus o de un serotipo de adenovirus que transcomplementa el primer adenovirus, y además en presencia de genes estructurales adenovirales necesarios procedentes del extremo izquierdo del adenovirus.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la generación de un adenovirus quimérico para su crecimiento en una célula anfitrión seleccionada, estando dicho adenovirus quimérico derivado de una cepa de adenovirus parental que es incapaz de un crecimiento eficiente en dicha célula anfitrión, comprendiendo dicho método la etapa de generar un adenovirus quimérico que comprende: regiones terminales 5’ y 3’ de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dichas regiones terminales 5’ las repeticiones terminales invertidas (ITRs) y funciones de gen E1 necesarias, y comprendiendo dichas regiones terminales 3’ repeticiones termines invertidas (ITRs) y funciones de gen E4 necesarias; y, regiones internas de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones la

hexon, una base de penton y fibra, en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ hasta 3’, la región terminal del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y las regiones terminales 3’ del primer adenovirus.

La invención proporciona también un adenovirus quimérico que comprende una proteína hexon de un serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecer de forma eficiente en una célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicho adenovirus modificado: (a) secuencia de adenovirus del extremo terminal izquierdo de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región extrema izquierda las repeticiones terminales invertidas (ITRs) de E1a, E1b y 5’; (b) secuencias de adenovirus de la región interna del serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecer de forma eficiente en la célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región interna los genes que codifican la penton, la hexon y la fibra del adenovirus seleccionado; (c) secuencias de adenovirus del extremo terminal derecho del primer adenovirus, comprendiendo dicha región extrema derecha las funciones de gen E4 necesarias y las repeticiones terminales invertidas (ITRs) 3’, en donde el adenovirus quimérico resultante comprende proteínas adenovirales estructurales y reguladoras necesarias para infección y replicación.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 proporciona el mapa del genoma del adenovirus de simio generado por clonación shotgun según se describe en el ejemplo que sigue;

La Figura 2 proporciona el mapa del virus quimérico Adhu5-SV25 recombinante, denominado H5S25H5.

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona genomas de adenovirus quiméricos compuestos por el extremo terminal izquierdo y por el extremo terminal derecho de un adenovirus que puede ser cultivado en la célula anfitrión seleccionada, y las regiones internas que codifican, como mínimo, las proteínas de cápside de otro serotipo de adenovirus. Esta invención es particularmente ventajosa para generar adenovirus que tienen serotipos que son difíciles de cultivar en un tipo de célula deseada. La invención permite así la generación de adenovirus quiméricos de serotipos variables.

En las realizaciones ilustradas en la presente memoria, los adenovirus quiméricos han sido construidos donde la mayor parte de las proteínas estructurales, y no solamente la hexon o la fibra, se derivan de un adenovirus de un serotipo universal, conservando con ello la mayor parte de las interacciones de proteína-proteína que están involucradas en el ensamblaje de cápside. La mayor parte de los genes precoces, tal como los codificados por las regiones de adenovirus E1 y E4 que son responsables de la regulación de transcripción y de la regulación del ciclo de la célula anfitrión, son retenidos a partir de diferentes serotipos que se sabe que dan como resultado una generación de virus de título alto en los... [Seguir leyendo]

1. Un método para cultivar eficientemente un adenovirus quimérico en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico procedente de una cepa de adenovirus parental incapaz de crecimiento eficiente en la citada célula anfitrión, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) generar un adenovirus quimérico que comprende:

(i) secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo y del extremo terminal derecho de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región de extremo izquierdo las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’, y comprendiendo dicha región de extremo derecho las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 3’, y

(ii) las regiones internas de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones internas los genes tardíos que codifican la penton, la hexon y la fibra;

en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ hasta 3’, una región terminal izquierda del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y la región terminal derecha del primer adenovirus, y

(b) cultivar dicho adenovirus quimérico en presencia de genes E1a, E1b y E4 ORF6 de adenovirus funcional procedentes del primer adenovirus o de un serotipo de adenovirus que transcomplementa el primer adenovirus, y además en presencia de genes estructurales adenovirales necesarios procedentes del extremo izquierdo del adenovirus.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región interna del adenovirus parental comprende además uno o más genes de adenovirus funcional seleccionados en el grupo consistente en trama de lectura abierta de endoproteasa, proteína de enlace de ADN, proteína de andamiaje de 100 kDa, proteína de 33 kDa, proteína VIII, pTP, proteína de 52/55 kDa, proteína VII, Mu y proteína VI.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las funciones de polimerasa, proteína terminal y proteína de 52/55 kDa se proporcionan en trans.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer adenovirus comprende además las funciones de polimerasa, proteína terminal y proteína de 52/55 kDa.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus quimérico comprende los genes 1, 2, 3, 4 y 5 tardíos adenovirales del adenovirus parental.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula anfitrión seleccionada contiene establemente una o más de las funciones E1a, E1b o E4 ORF6 de adenovirus.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus quimérico comprende uno o más de los E1a, E1b o E4 ORF6 del primer adenovirus.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer adenovirus es de origen humano.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer adenovirus de origen simio.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de aislar el adenovirus quimérico.

11. Un método para generar un adenovirus quimérico para su crecimiento en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico derivado de una cepa de adenovirus parental incapaz de crecimiento eficaz en dicha célula anfitrión, comprendiendo dicho método la etapa de generar un adenovirus quimérico que comprende:

regiones terminales 5’ y 3’ de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dichas regiones terminales 5’ las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’ y las funciones de gen E1 necesarias, comprendiendo dichas regiones terminales 3’ repeticiones de terminal invertido (ITRs) y las funciones de gen E4 necesarias, y

regiones internas procedentes de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones terminales la hexon, la penton base y la fibra;

en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ a 3’, la región terminal 5’ del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y las regiones terminales 3’ del primer adenovirus.

12. Un adenovirus quimérico que comprende una proteína hexon de un serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecimiento eficiente en una célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicho adenovirus modificado:

(a) secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región de extremo izquierdo los E1a, E1b y repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’;

(b) secuencias de adenovirus de la región interna del serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecimiento eficiente en la célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región interna los genes que codifican la penton, la hexon y la fibra del adenovirus seleccionado;

(c) secuencias de adenovirus del extremo terminal derecho del primer adenovirus, comprendiendo dicha región de extremo derecho las funciones de gen E4 necesarias y las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 3’,

en donde el adenovirus quimérico resultante comprende proteínas adenovirales estructurales y reguladoras necesarias para infección y replicación.

13. El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico comprende además la proteína IIIa, la 52/55 kDa y la proteína terminal (pTP) del serotipo de adenovirus seleccionado.

14. El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico comprende la polimerasa del primer adenovirus.

15. El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico expresa una proteína quimérica funcional formada a partir del primer adenovirus y del adenovirus seleccionado, donde dicha proteína quimérica se selecciona a partir del grupo consistente en polimerasa, proteína terminal, proteína de 52/55 kDa, y similares.

16. El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico comprende la proteína terminal, la 52/55 kDa, y/o la IIIa del adenovirus seleccionado.

17. El adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde el adenovirus comprende además un gen heterólogo que codifica un producto deseado bajo el control de secuencias de control de expresión que dirigen la expresión del mismo en una célula objetivo.

18. Una composición que comprende el adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en un portador farmacéuticamente aceptable.

19. Un célula anfitrión que comprende un adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en cultivo.

20. La célula anfitrión de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha célula anfitrión es una célula humana.

21. Uso de un adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en la preparación de un medicamento, en donde el adenovirus quimérico comprende además un gen heterólogo que codifica un producto deseado bajo el control de secuencias de control de expresión que dirigen la expresión del mismo en una célula objetivo.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el medicamento es para su uso en un método para administración repetitiva de un gen heterólogo a un mamífero, que comprende las etapas de introducir en dicho mamífero un primer vector que comprende el gen heterólogo, e introducir en dicho mamífero un segundo vector que comprende el gen heterólogo, en donde al menos el primer vector o el segundo vector es un adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, y en donde el primer y el segundo vector son diferentes.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde el adenovirus quimérico comprende un gen heterólogo que codifica un antígeno de un agente infeccioso, siendo dicho medicamento útil para inducir una respuesta inmune.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en donde el primer vector es una vacuna de ADN que prepara al mamífero respecto al segundo vector que es un adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 23.

25. Un método para la producción de un producto de gen seleccionado que comprende infectar una célula de mamífero con adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, cultivar dicha célula bajo condiciones adecuadas, y recuperar desde dicho cultivo de célula el producto de gen expresado.