Método de expansión de condrocitos con conservación fenotípica.

Un método para producir tejido cartilaginoso in vitro, comprendiendo el método:

a) aislar una población de condrocitos de tejido cartilaginoso donante aislado;

b) expandir la población de condrocitos cartilaginosos en un medio de expansión y en un sustrato en condiciones eficaces para impedir la adhesión al sustrato de una mayoría de los condrocitos, en el que las condiciones comprenden expandir la población de células usando condiciones que comprenden:

(i) un sustrato que tiene un recubrimiento de ácido hialurónico; o

(ii) un sustrato no modificado que usa un medio de expansión que comprende ácido hialurónico en solución; c) sembrar una pluralidad de condrocitos de la población expandida de condrocitos cartilaginosos en un medio de producción tisular que comprenda TGF-β, en un sustrato de policarbonato que tenga una pluralidad de poros a través del mismo, teniendo los poros un diámetro interno de al menos 1 micra a aproximadamente 12 micras; y

d) cultivar los condrocitos sembrados en el medio de producción tisular en el sustrato de policarbonato poroso durante un periodo de tiempo suficiente para que los condrocitos produzcan matriz extracelular, produciendo de este modo in vivo un tejido cartilaginoso cultivado caracterizado por una organización de células al azar.

Método de expansión de condrocitos con conservación fenotípica Antecedentes de la invención Millones de personas solo en los Estados Unidos padecen artritis degenerativa o dolor inflamatorio que limita la función normal de las articulaciones y produce la pérdida de calidad de vida. La principal causa de la artritis degenerativa es la degradación de la matriz cartilaginosa. El cartílago es un tejido conectivo blando, flexible, que cubre las terminaciones de una articulación que actúa como amortiguador de los huesos y permite que la articulación se mueva fácilmente sin dolor. La pérdida de cartílago articular en las articulaciones debido a lesión traumática o a enfermedad produce finalmente rigidez articular causada por "movimiento de hueso sobre hueso" y exposición al dolor de las terminaciones nerviosas en huesos subcondriales.

En mamífero, el cartílago contribuye a la estructura de diversos órganos y sistemas como la superficie articular de las articulaciones y otras estructuras asociadas con las articulaciones, incluyendo el oído, la nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, estructuras de las válvulas cardíacas, etc. Existen diferentes tipos de cartílago en mamíferos: fibrocartílago, cartílago elástico y cartílago hialino. El fibrocartílago contiene un colágeno de tipo I abundante y se encuentra en los discos intervertebrales y ligamentos. El cartílago elástico contiene fibrillas de elastina y se encuentra en los pabellones auriculares en la epiglotis. El cartílago hialino, un tejido cartilaginoso semitransparente y claro encontrado en las paredes cartilaginosas de la tráquea y bronquios, el cartílago costal y la placa de crecimiento, así como en el cartílago de la nariz, laringe y articulaciones diartrodiales, no contiene colágeno de tipo I ni elastina. El cartílago hialino, que tiene una combinación característica de colágenos específicos de cartílago (tipos II, VI, IX y XI) y proteoglucanos de agregación (agrecano) que le proporcionan la habilidad exclusiva de resistir fuerzas compresivas, se denomina cartílago articular.

Los daños producidos en el cartílago articular dan lugar a lesiones de la superficie articular y la degeneración progresiva de estas lesiones a menudo conducen a artralgia sintomática, minusvalía y funcionalidad reducida o alterada. Los defectos de la superficie articular pueden ser el resultado de diversas etiologías, incluyendo procesos inflamatorios, neoplasias, sucesos post-traumáticos y degenerativos, etc. El cartílago articular adulto tiene un inconveniente principal: a diferencia de la mayoría de los tejidos, no puede restaurarse por sí mismo. La ausencia de aporte sanguíneo limita en gran parte la capacidad de los tejidos para acumular células condroprogenitoras que pueden actuar restaurando los defectos del cartílago articular. En consecuencia, los defectos del cartílago articular que han progresado a enfermedad degenerativa avanzada requieren artroplasia articular total para eliminar el dolor y restablecer la función articular normal.

El crecimiento tisular diseñado de cartílago articular representa una solución biológica que puede retrasar o reducir la necesidad de materiales basados en metales y polímeros normalmente utilizados en la artroplasia articular total. Se han intentado diversas estrategias biológicas para restaurar o regenerar el cartílago articular que está lesionado por traumatismo o enfermedad (Hunziker, 2003) . La mayoría de estas estrategias combinan terapia basada en células con polímeros biodegradables para crear una construcción tridimensional que puede trasplantarse en la rodilla. Sin embargo, estas terapias experimentales no han producido una restauración duradera del cartílago hialino (Buckwatler et al., 1990; Hunziker, 2002) .

Una técnica que ha merecido la aprobación de la FDA para la restauración del cartílago es el Implante de Condrocitos Autólogos (Carticel, Genzyme Surger y ) . En este procedimiento, se obtiene una pequeña biopsia tisular del cartílago articular del paciente tomada en el laboratorio en la que los condrocitos (células cartilaginosas) se aíslan y expanden ex vivo para su reimplante posterior en el paciente en un segundo procedimiento quirúrgico. Una limitación clave de este método es el número relativamente pequeño de células donantes que puede obtenerse en la biopsia, y condrocitos derivados del cartílago articular adulto parecen tener una capacidad limitada para producir matriz cartilaginosa después de la expansión.

Una estrategia satisfactoria de tejido diseñado para restaurar el cartílago puede usar células que pueden expandirse en un proceso gradual que es tanto eficaz como reproducible y que conserva la capacidad de que los condrocitos expandidos sinteticen cartílago funcional para su uso en el trasplante. Actualmente, la técnica más ampliamente usada para la expansión de condrocitos es el cultivo monocapa (Patente de Estados Unidos Nº 4.356.261) . Sin embargo, los condrocitos que crecen en cultivo monocapa usan un medio que contiene suero sometido a un proceso de desdiferenciación en el cual los condrocitos pierden su forma esférica y adquieren una morfología fibroblástica alargada. Los cambios bioquímicos asociados con la pérdida de la forma original de los condrocitos incluyen la síntesis detenida de los colágenos y proteoglucanos específicos de cartílago, la posterior iniciación de la síntesis de colágeno de tipo I y III y el aumento de la síntesis de pequeños proteoglucanos no agregantes.

La pérdida de fenotipo condrocitario durante la expansión en serie in vivo posee una limitación clave para la comercialización de estrategias ortobiológicas para la restauración del cartílago articular. Para contrarrestar la desdiferenciación, los condrocitos tradicionalmente se han suspendido en entornos tridimensionales tales como hidrogeles, por ejemplo, agarosa (Benya y Shafer, 1982) o alginato (Hauselmann et al., 1994 y 1996) , cultivo granular (Mackay et al., 1998; Jakob et al., 2001; Barbero et al., 2004) , o armazones tridimensionales (Vacanti et al.,

1998) . Se dice que los condrocitos conservan mejor su aspecto morfológico redondeado original y sintetizan macromoléculas características de cartílago hialino cuando se mantienen en cultivo de suspensión tridimensional después de la expansión. Sin embargo, muchos de dichos condrocitos cultivados aún producen colágeno de tipo I y pequeños proteoglucanos, indicando un fenotipo cartilaginoso "incompletamente" restaurado. Además, la posibilidad de transportar materiales residuales derivados de los hidrogeles tridimensionales puede complicar la ruta reguladora. Por ejemplo, el alginato, se dice que induce la inflamación y puede ser citotóxico cuando se usa in vivo. Una estrategia lógica para mantener el fenotipo condrocitario durante la expansión in vitro sería recapitular in vivo el microentorno en el cual los condrocitos se exponen naturalmente durante el desarrollo embrionario. Por lo tanto, matrices tales como ácido hialurónico, colágeno de tipo II y VI o proteoglucanos de agregación pueden servir como excelentes sustratos para la expansión y crecimiento de condrocitos, particularmente en ausencia de factores derivados de suero. Durante el desarrollo embrionario, la condensación y la proliferación de células progenitoras mesenquimáticas forman el precursor cartilaginoso a través de un proceso conocido como condrogénesis. Además, la diferenciación del molde cartilaginoso produce la formación de cartílago articular en las articulaciones y huesos. Se piensa que muchos factores desempeñan un papel crítico en la condrogénesis, incluyendo la matriz extracelular, factores de crecimiento y diferenciación, sus antagonistas así como receptores de membrana específicos de la superficie celular, incluyendo, N-cadherina, receptor de proteína morfogenética ósea de tipo 1A (BMPR-1A) y receptor de proteína morfogenética ósea de tipo 1 B (BMPR-1 B) . Un componente importante de la matriz extracelular, el ácido hialurónico (AH) desempeña un papel crítico en el desarrollo del cartílago y en el mantenimiento de la homeostasis tisular. El AH es un glucosaminoglucano lineal, no sulfatado, de la matriz extracelular que consta de unidades de repetición de ácido (β, 1-4) D-glucurónico- (β1-3) -N-acetil-D-glucosamina (Laurent, 1970) . El AH se distribuye en cualquier parte en los tejidos corporales y se ha observado que desempeña una función importante en diversos procesos biológicos incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y el crecimiento tumoral proporcionando una matriz provisional que da soporte a la migración, adherencia, proliferación y diferenciación celular (Laurent y Fraser, 1992) . En su estado original, el AH existe como un polímero... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir tejido cartilaginoso in vitro, comprendiendo el método:

a) aislar una población de condrocitos de tejido cartilaginoso donante aislado;

b) expandir la población de condrocitos cartilaginosos en un medio de expansión y en un sustrato en condiciones eficaces para impedir la adhesión al sustrato de una mayoría de los condrocitos, en el que las condiciones comprenden expandir la población de células usando condiciones que comprenden:

(i) un sustrato que tiene un recubrimiento de ácido hialurónico; o

(ii) un sustrato no modificado que usa un medio de expansión que comprende ácido hialurónico en solución;

c) sembrar una pluralidad de condrocitos de la población expandida de condrocitos cartilaginosos en un medio de producción tisular que comprenda TGF-β, en un sustrato de policarbonato que tenga una pluralidad de poros a través del mismo, teniendo los poros un diámetro interno de al menos 1 micra a aproximadamente 12 micras; y

d) cultivar los condrocitos sembrados en el medio de producción tisular en el sustrato de policarbonato poroso durante un periodo de tiempo suficiente para que los condrocitos produzcan matriz extracelular, produciendo de este modo in vivo un tejido cartilaginoso cultivado caracterizado por una organización de células al azar.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que después de al menos 3, 8 duplicaciones de la población de condrocitos, al menos 50 % de los condrocitos conservan la morfología redondeada y la expresión génica de cartílago hialino.

3. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el tejido cartilaginoso donante comprende tejido cartilaginoso hialino inmaduro y los condrocitos comprenden condrocitos cartilaginosos hialinos inmaduros.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la expansión de la población de células en condiciones de adhesión baja comprenden expandir la población de células usando un sustrato que tiene un recubrimiento de ácido hialurónico.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la expansión de la población de células en condiciones de adhesión baja comprende expandir la población de células usando un sustrato no modificado y un medio de expansión que comprende ácido hialurónico en solución.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el medio de expansión comprende medio asérico y adicionalmente de modo opcional comprende TGF-β, FGF, L-Glutamina y Vitamina C.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la población de condrocitos comprende condrocitos de sinovio capsular, condrocitos de periostio, condrocitos articulares juveniles o condrocitos articulares adultos.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la expansión de la población de condrocitos comprende:

una primera expansión celular; y

una segunda expansión celular;

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende, después de sembrar la población de condrocitos en un sustrato de policarbonato para producir matriz extracelular, exponer la población de condrocitos a TGF-β en el medio de producción tisular durante un periodo de aproximadamente siete (7) días.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9 que adicionalmente comprende mantener la población de condrocitos en el medio de producción tisular a un nivel predeterminado de oxígeno y dióxido de carbono durante un periodo de cultivo de aproximadamente cuarenta y cinco (45) a aproximadamente sesenta y cinco (65) días.

11. Un cultivo celular que comprende una población expandida de condrocitos que expresa un fenotipo natural y un nivel natural de expresión génica de cartílago hialino que puede obtenerse mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo preferentemente la población de condrocitos, condrocitos de sinovio capsular, condrocitos de periostio, condrocitos articulares juveniles, condrocitos articulares adultos o condrocitos transgénicos resistentes a rechazo de xenoinjerto mediado por el sistema inmunitario y una membrana de policarbonato que tiene una pluralidad de poros a través de la misma, teniendo los poros un diámetro interno de al menos aproximadamente 1 μm a aproximadamente 12 μm.