MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE LA GLICOFORMA BETA DE ANTITROMBINA.

La presente invención se refiere a un método para detectar y/o cuantificar la glicoforma beta de la antitrombina,

a un método para el diagnóstico de una patología tromboembólica mediante la determinación de la glicoforma beta de la antitrombina.

Método de cuantificación de la glicoforma beta de antitrombina.

Campo de la invención La presente invención se encuadra fundamentalmente en el área de la hemostasia, siendo el principal sector de aplicación el sanitario con fines diagnósticos y pronósticos en hematología, cardiología, neurología, oncología, cirugía y ginecología. Es también aplicable a la investigación en modelos animales de cualquiera de estas enfermedades.

Estado de la técnica La antitrombina es una serpina muy conservada en la escala filogenética que actúa como el anticoagulante endógeno más relevante en la hemostasia, como lo demuestra el hecho de que su deficiencia completa es letal, y la deficiencia parcial tanto adquirida como congénita incrementa de forma muy significativa el riesgo trombótico (Ishiguro y col. J Clin Invest. 2000;106:873-8) .

La determinación de los niveles de antitrombina es una de las pruebas incluidas en los estudios de trombofilia que se aplican a pacientes con episodios trombóticos tempranos, recurrentes, con historia familiar o localización inusual (Heit JA. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:127-35) . Esta prueba se realiza habitualmente evaluando la actividad anticoagulante (anti-FXa o anti-IIa) del plasma mediante sistemas cromogénicos, aunque el estudio completo de la deficiencia de antitrombina implica determinación de niveles antigénicos, afinidad por heparina y análisis molecular (Cooper y col. Int J Lab Hematol. 2011 Mar 15; Patnaik y Moll. Haemophilia. 2008; 14:1229-39) . Estos métodos detectan y definen la deficiencia congénita o adquirida de este potente anticoagulante, que se asocia con un elevado riesgo trombótico (OR: 10-50) , aunque su incidencia en la población general es baja (Patnaik y Moll. Haemophilia. 2008; 14:1229-39) .

Existen dos glicoformas de antitrombina en plasma. La glicoforma alfa, con 4 N-glicanos, es la mayoritaria (9095%) , mientras que la glicoforma beta, que carece de N-glicosilación en posición 135, es la minoritaria (5-10%) . La generación de glicoforma beta se explica por la presencia de un residuo serina en posición 137, dentro de la secuencia consenso responsable de la N-glicosilación de la asparragina (N) 135. La presencia de serina en vez de treonina en posición 137 reduce la eficiencia del primer proceso de incorporación del núcleo glucídico al esqueleto proteico (Picard y col. Biochemistr y 1995; 34:8433-40) . La ausencia del componente glucídico en el residuo N135 tiene importantes consecuencias funcionales, ya que aumenta de dos a cinco veces la afinidad por heparina y otros glicosaminoglicanos como el heparán sulfato (Peterson & Blackburn. J Biol Chem 1985; 260: 610–5; McCoy y col. J Mol Biol. 2003; 326:823-33) , proceso clave en la activación de la actividad anticoagulante de la antitrombina (Turk y col. Biochemistr y 1997. 36:6682-91) .

El papel fisiológico de la glicoforma beta de antitrombina no ha sido completamente definido, pero la mayor afinidad por heparina junto a diferentes estudios realizados en modelos animales de patología trombótica sugieren que la glicoforma beta de antitrombina es la que mayor potencial antitrombótico tiene, al menos en la superficie endotelial (Felcsh & Owen. Biochemistr y 1994; 33:818-22; Witmer y cols Arterioscler Thromb 1991, 11:530-9; Frebelius y cols. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1996;16:1292-7) .

Estos datos sugieren que la glicoforma beta de antitrombina es el principal anticogulante in vivo (Swedenborg J. Blood Coagul Fibrinolysis. 1998;9 Suppl 3:S7-10; McCoy y col. J Mol Biol. 2003;326:823-33) y por tanto, variaciones en los niveles de la glicoforma beta de antitrombina podrían tener relevancia en patología tromboembólica, arterial y venosa, así como en situaciones donde las complicaciones trombóticas son frecuentes como en pacientes con cáncer, cirugía, inmovilización, embarazo y parto, etc.

En este contexto, la cuantificación de los niveles de glicoforma beta en plasma es un objetivo relevante. El problema diagnóstico es que la cadena proteica es exactamente igual en las dos glicoformas de antitrombina, y los estudios funcionales no discriminan las dos glicoformas, por lo que un estudio global, prima a la forma mayoritaria (alfa) . Por tanto, los estudios disponibles actualmente no detectan modificaciones incluso relevantes en los niveles de glicoforma beta. Estas limitaciones exigen el desarrollo de métodos capaces de identificar de forma específica la glicoforma beta de antitrombina.

Se han desarrollado diferentes métodos que permiten discriminar las dos glicoformas de antitrombina:

1) Métodos de isoelectroenfoque o que combinan sistemas de masas y cromatografía líquida de alta presión en capilar (IEF and capillar y HPLC-ESI-MS/MS) (Plematl y col. Proteomics. 2005; 5:4025-33) .

2) Espectrometría de masas (Kleinova y col. J Mass Spectrom. 2004; 39:1429-36) , con diferentes aproximaciones como “on-line capillar y zone electrophoresis-electrospray ionization-quadrupole ion trap-mass spectrometr y ” (Demelbauer y col. Electrophoresis. 2004; 25:2026-32) .

3) Electroforesis en dos dimensiones y electroforesis capilar (Two-dimensional gel electrophoresis and capillar y electrophoresis) (Kremser y col. Electrophoresis. 2003; 24:4282-90) . 4) Variaciones de cromatografia líquida (Hydroxyapatite high-performance liquid chromatography) (Karlsson y Winge. Protein Expr Purif. 2003;28:196-201) . 5) Cromatografía de afinidad por heparina (Heparin affinity chromatography) (Heger y col. Thromb Res. 2002; 106:157-64) .

En todos estos métodos se requiere disponer de proteína pura o grandes cantidades de plasma, precisan equipos muy costosos y especializados y suelen consumir mucho tiempo. Además, muchos de estos sistemas no son cuantitativos.

Existe por tanto una necesidad de disponer de métodos sencillos, baratos y rápidos capaces de cuantificar los niveles de glicoforma beta de antitrombina de pequeñas cantidades de muestras biológicas, especialmente plasma.

Existen múltiples patentes relacionadas con antitrombina, especialmente el uso clínico de concentrados de antitrombina purificada del plasma o recombinante, o de sustancias que potencien la actividad anticoagulante de esta molécula como heparinas o similares (http://tgs.freshpatents.com/Antithrombin-Iii-bx1.php) , pero no para la detección y/o cuantificación de la glicoforma beta.

Descripción de la invención Así pues en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar y/o cuantificar glicoforma beta de la antitrombina que comprende:

a) contactar la muestra aislada de un sujeto, con heparina y una sal en elevada concentración (1.1M) , de tal forma que solo se activa la glicoforma beta de la antitrombina. b) cuantificación de la antitrombina activada En una realización en particular de la presente invención, la heparina es no fraccionada, de bajo peso molecular

o pentasacárido esencial.

En otra realización en particular de la presente invención, la sal es cloruro sódico.

En otra realización en particular de la presente invención el paso b) de cuantificación de la antitrombina activada se realiza mediante la determinación de la actividad inhibitoria de la antitrombina frente al factor Xa, IIa, IXa, o VIIa.

En una realización en particular, la muestra es plasma o un medio de cultivo.

En otra realización en particular, el plasma está anticoagulado con citrato o EDTA

En una realización en particular, la muestra de plasma es procedente de humanos o de ratón.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una patología tromboembólica que comprende el método para detectar y/o cuantificar la glicoforma beta de la antitrombina descrito anteriormente y posteriormente comparar los niveles obtenidos en el paso b) con niveles control, donde la presencia de niveles alterados de glicoforma beta de la antitrombina es indicativo de patología tromboembólica.

En la presente invención por patología tromboembólica nos referimos a cualquier patología tromboembólica producida por trombofilia, trombosis venosa, enfermedad periférica arterial, cardiopatía isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, arteriosclerosis, embarazo y puerperio, cirugía o cáncer.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de la glicoforma beta de la antitrombina como marcador de enfermedad tromboembólica.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección y/o cuantificación de la glicoforma beta de la antitrombina mediante el método de detección y/o cuantificación descrito anteriormente que comprende:

-Solución salina

1. Método para detectar y/o cuantificar glicoforma beta de la antitrombina que comprende:

a) contactar la muestra aislada de un sujeto, con heparina y una sal en una concentración 1.1M, de tal forma que solo se activa la glicoforma beta de la antitrombina. b) cuantificación de la antitrombina activada

2. Método según la reivindicación 1, donde la heparina es seleccionada de heparina de bajo peso molecular, heparina no fraccionada o pentasacárido esencial.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la sal es cloruro sódico.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el paso b) de cuantificación de la antitrombina activada se realiza de mediante la determinación de la actividad inhibitoria de la antitrombina como son la actividad anti-factor Xa, anti-factor IIa, anti-factor IXa, anti-factor VIIa.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la muestra es sangre, plasma o medio de cultivo.

6. Método para diagnosticar una patología tromboembólica que comprende el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y posteriormente comparar los niveles obtenidos en el paso b) con niveles control, donde la presencia de niveles alterados de glicoforma beta de la antitrombina es indicativo de patología tromboembólica.

7. Método según la reivindicación 6, donde la patología tromboembólica es producida por trombofilia, trombosis venosa, enfermedad periférica arterial, cardiopatía isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, arteriosclerosis, embarazo y puerperio, cirugía o cáncer.

8. Uso de la glicoforma beta de la antitrombina como marcador de enfermedad tromboembólica.

9. Kit para la detección y/o cuantificación de la glicoforma beta de la antitrombina según el método de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende:

- Solución salina

- Heparina,

-Al menos un factor de la coagulación de la sangre

-Al menos un sustrato cromogénico

10. Kit para diagnosticar una patología tromboembólica según el método de las reivindicaciones 6-7, caracterizado porque comprende:

- Solución salina

- Heparina,

-Al menos un factor de la coagulación de la sangre

-Al menos un sustrato cromogénico

11. Uso del kit según la reivindicación 9 para la detección y/o cuantificación de la glicoforma beta de la antitrombina.

12. Uso del kit según la reivindicación 10, para diagnosticar una patología tromboembólica.