Marcaje celular para técnicas de resonancia magnética nuclear.

Un método para marcar una célula, el método comprende poner en contacto la célula ex vivo con un reactivo de imagenología de fluorocarbono en condiciones tales que el reactivo de imagenología de fluorocarbono se asocia con la célula,

en donde dicha célula marcada se va administrar a un sujeto, en donde dichas células marcadas son detectables por imagenología de resonancia magnética de 19F y en donde dicha célula no es una célula madre embrionaria humana.

Mareaje celular para técnicas de resonancia magnética nuclear Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud provisional en EE UU No. 6/537.33, presentada el 16 de enero, 214 y la solicitud provisional en EE UU No. 6/621.961, presentada el 25 de octubre, 24.

Antecedentes

Muchos procesos biológicos se llevan a cabo por poblaciones dinámicas, móviles de células. Por ejemplo, las células del sistema inmunltario son reclutadas desde el torrente sanguíneo a áreas de inflamación o infección, lo que produce una acumulación de células ¡nmunltarlas en el sitio afectado. Una marcada infiltración de células ¡nmunitarias con frecuencia se produce en tejidos afectados por enfermedades autoinmunitarias, cánceres e Infecciones. Asimismo, el rechazo a trasplantes está mediado por células ¡nmunitarias del huésped que entran y destruyen el tejido trasplantado. También hay evidencia creciente de que las células madre que se originan en la médula ósea migran a través del torrente sanguíneo y ayudan en la regeneración de tejidos dañados.

Aunque las poblaciones de células dinámicas desempeñan un papel clave en enfermedades significativas, las tecnologías actuales para seguir el movimiento de células in vivo son bastante limitadas. Típicamente, los movimientos celulares se siguen solo en Instantáneas obtenidas por análisis histológico de biopsias de tejidos. Sin embargo, el proceso de muestreo de un tejido con frecuencia altera el comportamiento de las células, y solo se puede obtener un número limitado de biopsias de un tejido u órgano particular. Se ha hecho algún progreso estudiando movimientos celulares mediante ensayos in vitro y tejidos aislados ex vivo. Los instrumentos existentes para el análisis no invasivo de organismos vivos son, actualmente, poco adecuados para seguir células vivas. Las tecnologías de imágenes basadas en luz, tales como tecnologías de bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasas), con frecuencia son ineficaces en la visualizaclón de estructuras profundas porque la mayoría de los tejidos de mamíferos son ópticamente opacos. Las técnicas de tomografía de emisión de positrones (TEP) que usan sondas radioactivamente marcadas son muy sensibles. Sin embargo, la instrumentación de TEP con frecuencia está limitada a una resolución de varios milímetros y es Incapaz de resolver detalles finos de tejidos y órganos. Además, las células marcadas no se pueden detectar durante periodos de tiempo que se extiende más allá del periodo de semidesintegración del radioisótopo típico de TEP, y generalmente la TEP no es útil para estudios longitudinales. Para ganar un entendimiento fundamental de procesos celulares, se deben desarrollar nuevas vías para visualizar las dinámicas de población de tipos celulares específicos in vivo.

La imagenología por resonancia magnética (IRM) es una herramienta diagnóstica clínica muy usada porque es no invasiva, permite vistas en sujetos ópticamente opacos, y proporciona contraste entre tejidos blandos a una resolución espacial razonablemente alta. La IRM convencional se enfoca casi exclusivamente en visualizar anatomía y no tiene especificidad por ningún tipo de célula particular. La `sonda usada por la IRM convencional es el ubicuo protón (1H) en moléculas de agua móviles. Se necesitan nuevas clases de sondas o reactivos de IRM exógenos para facilitar la Imagenología específica de célula en sujetos vivos.

Compendio

La invención se refiere a las formas de realización como se caracterizan en las reivindicaciones.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona métodos y reactivos novedosos para marcar células ex vivo con un reactivo de imagenología de fluorocarbono, que se puede detectar por una técnica de resonancia magnética nuclear. Las células marcadas se pueden administrar a un sujeto y posteriormente detectar por técnicas de resonancia magnética nuclear. Los ejemplos de técnicas de resonancia magnética nuclear incluyen imagenología por resonancia magnética (IRM) y espectroscopia de resonancia magnética (ERM) localizada. Puesto que las técnicas de resonancia magnética nuclear generalmente se realizan como procedimientos no invasivos, las células marcadas se pueden detectar en uno o más puntos temporales en un sujeto vivo. Las células marcadas también se pueden detectar en un cultivo celular o en esencialmente cualquier otro medio en el que se pueda realizar la técnica de resonancia magnética nuclear, tal como explantes de tejido, órganos y tejidos retirados de un sujeto (posiblemente antes del trasplante en un receptor de trasplante), tejidos artificialmente generados y varias matrices y estructuras sembradas con células.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona métodos para marcar una célula, como se definen en las reivindicaciones. Tales métodos incluyen poner en contacto la célula ex vivo con un reactivo de imagenología de fluorocarbono en condiciones tales que el reactivo de imagenología de fluorocarbono se asocia con la célula. Los perfluoropoliéteres (PFPE) son ejemplos de reactivos de imagenología de fluorocarbono adecuados. Los perfluoropoliéteres pueden ser lineales o cíclicos (por ejemplo, éteres perfluoro-corona). Opcionalmente, la célula se puede poner en contacto con el reactivo de imagenología de fluorocarbono en presencia de un reactivo que aumenta la absorción del reactivo de imagenología de fluorocarbono. Los lípidos catiónicos son un ejemplo de un reactivo

adecuado que aumenta la absorción; se describen otros de tales reactivos en el presente documento y son, en vista de esta especificación, conocidos en la técnica. Mientras que un reactivo de imagenología de fluorocarbono puede ser internalizado por una célula, también se puede asociar con la superficie extracelular de una célula. La asociación con una superficie extracelular se puede aumentar conjugando el reactivo de imagenología a una fracción de direccionamiento celular. Una fracción de direccionamiento celular puede ser esencialmente cualquier entidad molecular que se une a las células deseadas, tal como un anticuerpo que se une a un epítopo que este expuesto al medio extracelular. La absorción de un reactivo de imagenología en una célula se puede aumentar conjugando el reactivo de imagenología con una fracción de internalización. Una fracción de internalización es cualquier entidad molecular que estimula o fomenta la entrada del reactivo de imagenología en la célula. Los ejemplos incluyen péptidos y fracciones de internalización que se unen a receptores u otros proteínas de superficie celular que se internalizan mediante, por ejemplo, endocitosis mediada por receptor. Un reactivo de imagenología se puede formular como una emulsión. La célula puede ser esencialmente cualquier célula, incluyendo células procariotas y eucariotas. En formas de realización preferidas, la célula es una célula de mamífero. En ciertas formas de realización la célula es una célula del sistema inmunitario, tal como una célula dendrítica. Una célula también puede ser una célula madre o una célula que se ha preparado para la administración a un sujeto como parte de una terapia celular o un trasplante, tal como trasplante de células madre de sangre periférica o trasplante de médula ósea.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona reactivos de imagenología de fluorocarbono. Los reactivos de imagenología de fluorocarbono preferidos tienen una o más de las siguientes propiedades: citotoxicidad tolerable, un espectro de 19F RMN que es sencillo, idealmente que tiene una resonancia única, estrecha para minimizar artefactos de desplazamiento químico; un gran número de átomos de flúor equivalentes en RMN por molécula; e idoneidad para la formulación para permitir el mareaje eficaz de muchos tipos de células. Los reactivos de imagenología de fluorocarbono preferidos incluyen perfluoroéteres lineales o cíclicos (por ejemplo, éteres perfluoro-corona). Los éteres perfluoro-corona preferidos incluyen perfluoro-15-corona-5, perfluoro-18-corona-6 y perfluoro-12-corona-4. En ciertas formas de realización, el reactivo de imagenología de fluorocarbono es un poliéter perfluorado que tiene una fórmula media:

XO(Y-OjnZ

en donde Y se selecciona del grupo que consiste en:

en donde n es un número entero de 8 a 2; en donde X y Z son iguales y se seleccionan del grupo que consiste en perfluoroalquilos, perfluoroéteres, perfluoroalquilos terminados con fluoroacilo, carboxilo, amida o éster, metiloles, cloruros ácidos, amidas, amidinas, acrilatos y ásteres. En una forma de realización particularmente preferida, n es 1-12, más preferiblemente 11. En una forma de realización adicional, X y/o Z son poliéteres que están... [Seguir leyendo]

1. Un método para marcar una célula, el método comprende poner en contacto la célula ex vivo con un reactivo de ¡magenologfa de fluorocarbono en condiciones tales que el reactivo de ¡magenología de fluorocarbono se asocia con la célula, en donde dicha célula marcada se va administrar a un sujeto, en donde dichas células marcadas son detectables por ¡magenología de resonancia magnética de 19F y en donde dicha célula no es una célula madre embrionaria humana.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula se pone en contacto con el reactivo de ¡magenología de fluorocarbono en presencia de un reactivo que aumenta la absorción.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el reactivo que aumenta la absorción comprende un lípldo catlónlco.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el reactivo de ¡magenología de fluorocarbono se formula como una emulsión.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la emulsión comprende partículas que tiene un diámetro medio de entre 3 y 5 nm.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el reactivo de ¡magenología de fluorocarbono es un perfluoro-corona éter.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el reactivo de ¡magenología es perfluoro-15-corona-5 éter.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el fluorocarbono es un polléter perfluorado que tiene una fórmula media:

X(Y-)nZ

en donde Y se selecciona del grupo que consiste en:

F F F F

en donde n es un número entero de 8 a 2; en donde X y Z son ¡guales y se seleccionan del grupo que consiste en perfluoroalquilos, perfluoroéteres, fluoroalquilos terminados con fluoroacilo, carboxilo, amida o éster, metiloles, cloruros ácidos, amidas, amidinas, acrilatos y ésteres.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el reactivo de ¡magenología comprende una fracción funcional adicional.

1. El método de la reivindicación 9, en donde la fracción funcional adicional es una fracción de detección.

11. El método de la reivindicación 8, en donde n=11.

12. El método de la reivindicación 8 u 11, en donde X y Z son perfluoroéteres terminados con un grupo carboxilo.

13. El método de la reivindicación 12, en donde cada carboxilo se deriva con un polietilenglicol.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde X y Z se derivan con una fracción de detección fluorescente.

15. El método de la reivindicación 1, en donde el reactivo de ¡magenología de fluorocarbono es un polímero de fluorocarbono lineal derivado en uno o más extremos del polímero con al menos una fracción funcional, en

donde la al menos una fracción funcional se selecciona del grupo que consiste en: una fracción de detección, una fracción hldrofílica, una fracción de direccionamiento y una fracción de absorción celular.

16. El método de la reivindicación 15, en donde el fluorocarbono lineal es un perfluoropolléter lineal.

17. El método de la reivindicación 15 o 16, en donde la al menos una fracción funcional es una fracción de detección.

18. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 17, en donde la fracción de detección se selecciona del grupo que consiste en: una fracción de detección fluorescente y una fracción de detección de TEP.

19. El método de la reivindicación 4, en donde la emulsión comprende un perfluoropoliéter y tiene un tamaño de partícula que varía de 1 a 5 nm.

2. El método de la reivindicación 19, en donde la emulsión es estable a temperaturas que varían de 4°C a 37°C.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además examinar al menos una parte del sujeto por una técnica de resonancia magnética nuclear, detectando de esta manera una célula marcada en un sujeto.

22. El método de la reivindicación 1, que comprende además recoger un conjunto de datos de 1H.

23. El método de la reivindicación 22, que comprende además generar e incluir una imagen de 19F y una imagen

de 1H.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 21 a 23, en donde el reactivo de imagenología de fluorocarbono es un perfluoropoliéter.

25. El método de la reivindicación 24, en donde el reactivo de imagenología de fluorocarbono se selecciona del grupo que consiste en: un perfluoropoliéter lineal, un perfluoropoliéter cíclico y una mezcla de los mismos.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en donde la célula se va a administrar al sujeto como parte de una pauta terapéutica celular.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en donde la célula es una célula madre.

28. El método de la reivindicación 1, en donde una formulación celular marcada se va a administrar a un sujeto, la

formulación comprende:

(a) una célula; y

(b) un reactivo de imagenología de fluorocarbono que se asocia con la célula.

29. El método de la reivindicación 28, en donde dicha formulación comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. El método de la reivindicación 28 o 29, en donde el reactivo de imagenología de fluorocarbono es un perfluoropoliéter.

31. El método de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 1 o 28 a 3, en donde al menos una parte del reactivo de imagenología de fluorocarbono se internaliza en la célula.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 o 28 a 31, en donde al menos una parte del reactivo de imagenología de fluorocarbono se asocia con la superficie extracelular de la célula.

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 o 28 a 32, en donde el reactivo de imagenología de fluorocarbono se conjuga a una fracción de direccionamiento celular.

34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 o 28 a 33, en donde la fracción de direccionamiento celular comprende un anticuerpo que se une a un epítopo que está expuesto al medio extracelular.

35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 o 28 a 34, en donde el reactivo de imagenología de fluorocarbono se conjuga a una fracción de internalización.

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, 21 a 27 o 28 a 35, en donde la célula es una célula de mamífero.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, 21 a 27 o 28 a 36, en donde la célula es una célula del sistema ¡nmunitarlo.

38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, 21 a 27 o 28 a 37, en donde la célula es una célula dendrítlca.

39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 38, en donde la célula se prepara para su uso en una pauta terapéutica celular.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células detectables son células trasplantadas que se van a detectar en un receptor de trasplante.

41. El método de la reivindicación 4, en donde la localización y opcionalmente el tráfico de células marcadas se detecta en el receptor del trasplante.

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 41, en donde el receptor del trasplante es un receptor de trasplante de médula ósea.

43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 42, en donde las células para el trasplante comprenden células madre hematopoyéticas.

44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 43, en donde las células para el trasplante derivan de médula ósea, sangre de cordón umbilical o sangre periférica.

45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 44, en donde el receptor del trasplante es un receptor de un órgano donante.

46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 45, en donde al menos una parte de las células del órgano donante están marcadas con reactivo de ¡magenologfa de fluorocarbono.