Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos mediando utilización de bacterias corineformes.

Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos,

caracterizado por que

se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) Cultivación de las bacterias corineformes recombinantes que producen el L-aminoácido deseado, en las que se presenta expresado por lo menos el polinucleótido heterólogo glpK, que codifica un polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, o sobreexpresado el polinucleótido endógeno glpK, en un medio que contiene glicerol o eventualmente de manera adicional una o varias fuentes de C en unas condiciones, en las que el deseado L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y eventualmente

b) aislamiento del L-aminoácido deseado, permaneciendo en el producto final eventualmente los componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad o en porciones (desde >0 hasta 100 %). realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpK, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16

y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpK, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38.

Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos mediando utilización de bacterias corineformes Son objeto del invento unas bacterias corineformes recombinantes, en las cuales es (son) expresado (s) por lo menos uno o varios de los genes heterólogos del metabolismo del glicerol (en inglés "glycerol metabolism") , que se escoge (n) entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, así como unos procedimientos para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, conteniendo el medio glicerol como fuente de carbono, mediando utilización de estas bacterias. Estas bacterias muestran la capacidad para el aprovechamiento del glicerol y por consiguiente para la formación y el enriquecimiento eficaces de los L-aminoácidos.

Estado de la técnica Unos compuestos químicos, por los que se entienden en particular los L-aminoácidos, las vitaminas, los nucleósidos y los nucleótidos, y los D-aminoácidos, encuentran uso en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la cosmética, en la industria alimentaria y en la nutrición de animales.

Numerosos de estos compuestos son producidos por fermentación de unas cepas de bacterias corineformes, en particular de Cor y nebacterium glutamicum. A causa de su gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones o las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estas bacterias se usan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas que son resistentes frente a unos antimetabolitos tales como p.ej. el compuesto análogo a la lisina S- (2-amino-etil) -cisteína o el compuesto análogo al triptófano 5-fluoro-triptófano, o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para la regulación y que producen L-aminoácidos.

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Cor y nebacterium glutamicum que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de L-aminoácidos. Una exposición recopilativa acerca de los más diversos aspectos de la genética, del metabolismo y de la biotecnología de Cor y nebacterium glutamicum se encuentra en la obra de Pühler (coordinador de edición jefe) : Journal of Biotechnology 104 (1-3) , 1-338 (2003) y en la obra "Handbook of Cor y nebacterium glutamicum" (Manual de Cor y nebacterium glutamicum) de Eggeling y Bott (coordinadores de edición) , CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005) ) .

La totalidad de la industria de fermentación para la producción de L-aminoácidos utiliza como fuente de carbono hoy en día en la mayoría de los casos glucosa o sacarosa, que se obtienen en el caso de la elaboración de productos agrarios. Puesto que, sin embargo, está aumentando el precio de estas fuentes de carbono, es deseable una alternativa realizable tecnológicamente para la producción de los L-aminoácidos, de manera preferida de L-lisina y L-triptófano, el aprovechamiento de un material más barato como una materia prima alternativa para la fermentación.

El glicerol (propanotriol) es un componente natural de los aceites y las grasas, y une en forma de un "puente" a las moléculas de ácidos grasos en los triglicéridos. La molécula del glicerol es fuertemente polar y por lo tanto bien soluble en agua. Como producto de copulación o acoplamiento, esta valiosa materia prima resulta en el caso de la producción de un gasóleo biológico (= biodiesel) (p.ej. para el éster metílico de aceite de colza, RME) y se emplea en cosméticos, productos farmacéuticos, alimentos y para usos técnicos. Para el empleo del glicerol como una materia prima para la producción de componentes de piensos es decisiva la baratura. Se ha de partir del hecho de que con una producción creciente de gasóleo biológico, el glicerol se volverá interesante para la producción de aditivos para piensos.

El Cor y nebacterium glutamicum de tipo silvestre utiliza un gran número de azúcares monómeros y oligómeros tales como glucosa, sacarosa o maltosa como fuente de carbono (Vahjen y colaboradores, FEMS Microbiology Ecology [Microbiología eología] 18: 317-328 (1995) ) , pero no crece en glicerol como única fuente de carbono.

El Cor y nebacterium glutamicum de tipo silvestre dispone de algunos genes con una homología para genes conocidos del metabolismo del glicerol, pero hasta ahora no se pudo esclarecer porqué, a pesar de todo, no es posible el crecimiento en glicerol.

Misión del invento Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unos nuevas bacterias corineformes, que estén en la situación de aprovechar el glicerol, a ser posible como la única fuente de carbono. Otra misión adicional, que está en conexión directa con este hecho, fue la de poner a disposición un procedimiento mejorado para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, con ayuda de tales bacterias corineformes. En particular, de esta manera se debería hacer aprovechable al glicerol para una producción por fermentación de L-aminoácidos de un modo lo más rentable que sea posible.

Descripción del invento Los problemas planteados por estas misiones, así como por otras misiones no mencionadas explícitamente, que se pueden descubrir o deducir sin problemas a partir de las conexiones discutidas en este contexto, son resueltos mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1. Unas convenientes modificaciones y formas de realización del invento son puestas bajo protección en las reivindicaciones que se retrotraen a la reivindicación 1.

La descripción divulga unas bacterias corineformes recombinantes, que en particular ya segregan unos Laminoácidos, y en las cuales es (son) expresada (s) por lo menos una o varias de las secuencia (s) de nucleótidos que codifica (n) los productos génicos heterólogos del metabolismo del glicerol (en inglés "glycerol metabolism") , que se escoge (n) entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC. Estas bacterias muestran la capacidad para el aprovechamiento del glicerol.

A las bacterias utilizadas pertenecen en particular unas bacterias corineformes, en las cuales es expresado por lo menos un polinucleótido heterólogo, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en por lo menos un 80 % o en por lo menos un 90 %, en particular en por lo menos un 95 %, de manera preferida en por lo menos un 98 %, de manera especialmente preferida en por lo menos un 99 % y de manera muy especialmente preferida en un 100 % con respecto a una secuencia de aminoácidos, que se escoge entre el conjunto que se compone de las SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, ID No. 34 y SEQ ID No. 36.

Las mencionadas bacterias contienen de manera preferida por lo menos un polinucleótido heterólogo, que se escoge entre el conjunto que se compone de:

a) Un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 y unas secuencias de nucleótidos complementarias con éstas;

b) Un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 dentro del marco de la degeneración del código genético;

c) Una secuencia de polinucleótidos con una secuencia, que se hibrida con la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) Cultivación de las bacterias corineformes recombinantes que producen el L-aminoácido deseado, en las que se presenta expresado por lo menos el polinucleótido heterólogo glpK, que codifica un polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, o sobreexpresado el polinucleótido endógeno glpK, en un medio que contiene glicerol o eventualmente de manera adicional una o varias fuentes de C en unas condiciones, en las que el deseado L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y eventualmente b) aislamiento del L-aminoácido deseado, permaneciendo en el producto final eventualmente los componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad o en porciones (desde > 0 hasta 100 %) .

realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpK, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16

y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpK, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el polipéptido heterólogo con la actividad de una glicerol cinasa tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que en las bacterias recombinantes de la especie Cor y nebacterium glutamicum, que producen el L-aminoácido deseado, se presenta sobreexpresado adicionalmente el polinucleótido heterólogo glpD, que codifica un polipéptido con la actividad de una glicerol-3fosfato deshidrogenasa, o el polinucleótido endógeno glpD, realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpD, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpD, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el polipéptido heterólogo con la actividad de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8.

5. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 4, en las cuales el polinucleótido heterólogo expresado procede de un organismo procariótico, de manera preferida de Enterobacteriaceae, de manera muy especialmente preferida de Escherichia coli.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que como fuente de C se emplea el glicerol en ≥ 10 hasta 100 %.

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que se produce L-lisina o L-triptófano.

8. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado por que se emplean unas bacterias, en las cuales han sido reforzadas por lo menos parcialmente las rutas del metabolismo, que aumentan la formación del deseado L-aminoácido.

9. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado por que se emplean unas bacterias, en las cuales se han desconectado por lo menos parcialmente las rutas del metabolismo que disminuyen la formación del deseado L-aminoácido.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, se fermentan unas bacterias de la especie Cor y nebacterium glutamicum, en las cuales se refuerza (n) , en particular se sobreexpresa (n) , uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysCFBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppCFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf y zwf A243T, glpA, glpB, glpC, glpE, glpF, glpG, qlpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la actividad o concentración de la (s) proteína (s) , que es (son) codificada (s) por el (los) gen (es) reforzado (s) , aumenta en cada caso en 10 hasta 2.000 %, referida a la de la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-lisina, se fermentan unas bacterias de la especie Cor y nebacterium glutamicum, en las cuales, de manera simultánea, se debilita (n) , en particular se desconecta (n) o se disminuye la expresión de, uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB,

gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB y zwa2.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que la actividad o concentración de la (s) proteína (s) , que es (son) codificada (s) por el (los) gen (es) debilitado (s) , disminuye en cada caso a un 0 hasta 75 %, referido a la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o concentración de la proteína en el

microorganismo de partida.