Procedimiento para la producción de vacunas víricas.

Un procedimiento para la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos que comprende

a) inoculación de células con virus con cubierta infecciosos en un fluido,

en la que dichas células son células primarias o una línea celular cultivada,

b) propagación de dichos virus en dichas células, en la que dichas células están en forma de un cultivo celular,

c) recoger dicho virus propagado,

d) inactivar completamente dicho virus recogido directamente después de la recolección del virus antes de cualquier etapa de purificación, y en la que el fluido que contiene el virus o sus constituyentes no víricos no es (son) adicionalmente concentrados antes de dicha etapa de inactivación, y

e) tratar dicho virus inactivado con detergente para producir una vacuna vírica fraccionada, dando como resultado una preparación que comprende antígenos víricos.

Procedimiento para la producción de vacunas víricas Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para la producción de vacunas víricas.

Descripción de la técnica relacionada Una vacuna es una composición inmunógena de una sustancia antigénica, por ejemplo, un patógeno (no infeccioso) tal como un virus, su cubierta, partículas o sus antígenos proteicos. La administración o la vacunación dan como resultado la inmunización de un sujeto, por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, o un ave. La vacunación podría producir una reacción específica a la vacuna y alguna inflamación leve, pero generalmente esto es mucho menos perjudicial que una infección por un virus completamente viable para cuya prevención está diseñada la vacuna. El sistema inmunitario de los sujetos se adaptará por sí mismo para reconocer específicamente los antígenos de la vacuna e inactivará rápidamente el patógeno tras una exposición subsiguiente del sujeto al patógeno. Por lo tanto, a través de la vacunación se consigue un aumento en la resistencia frente al patógeno.

Con fines vacunales, convencionalmente se cultiva un virus en un cultivo celular adecuado o generalmente un sustrato celular. En el caso de la gripe se usan normalmente huevos de pollo embrionados. La cosecha de virus infecciosos se recoge y se purifica para eliminar los constituyentes celulares no víricos no deseados. En particular, en el caso de vacunas derivadas de sustratos de pollo, son posibles reacciones alérgicas a las proteínas del pollo/huevo en ciertos individuos susceptibles.

Una etapa fundamental en la producción de vacunas víricas es la inactivación del virus infeccioso. La formalina (una disolución acuosa de formaldehído) es el agente de inactivación usado con más frecuencia en la elaboración de vacunas. Habitualmente se usa en forma de una disolución acuosa saturada con una concentración de aproximadamente el 37 % de formaldehído. El formaldehído inactiva un virus mediante la reticulación irreversible con los grupos de amina primaria de las proteínas superficiales con otros átomos de nitrógeno próximos de la proteína o del ADN a través de un enlace -CH2-. En particular, estas reticulaciones podrían dar lugar a enlaces con sustancias no víricas, y por lo tanto es necesario realizar alguna purificación previa sobre el virus infeccioso vivo, dado que la inactivación previa a la purificación daría lugar a una gran cantidad de puentes químicos irreversibles entre las proteínas víricas y las impurezas, que son perjudiciales para la eficacia de las operaciones de purificación y la calidad del producto. Por esta razón, los virus infecciosos vivos son en primer lugar purificados al menos parcialmente en la técnica anterior, por ejemplo, mediante ultracentrifugación zonal, y después inactivados (documento US6.048.537) . La etapa de inactivación con formalina ha sido validada con procedimientos analíticos establecidos.

Como complemento al tratamiento con formalina, se ha considerado la inactivación mediante UV para su integración en el proceso de elaboración. El uso de una inactivación mediante irradiación ultravioleta en vacunas para seres humanos ha sido mostrado previamente para virus sin cubierta y con cubierta (documento US2006/0270017) . Dado que el genoma vírico es más susceptible a los daños por UV que los antígenos de la superficie del virus, se ha demostrado que la inactivación mediante UV tiene pocos efectos negativos sobre las características bioquímicas o la 45 inmunogenicidad del producto. Los objetivos para la inactivación mediante UV son principalmente los ácidos nucleicos, al contrario que las proteínas, a las que se dirige la formalina.

Mediante la combinación de la inactivación con formalina y UV, los científicos intentaron superar las limitaciones de la inactivación por UV o la inactivación por formalina por separado, respectivamente, para inactivar familias de virus particularmente resistentes.

Alternativamente, muchos fabricantes usan etapas del proceso basadas en detergentes tanto para inactivar el virus vivo como para modificar el virus. Estos procesos basados en detergentes desorganizan la cubierta lipídica del virus de la gripe para producir un antígeno de vacuna fraccionado (parcialmente desorganizado) o en subunidad

(completamente desorganizado) . El tratamiento con detergente a menudo reduce la reactividad del antígeno del virus, y por lo tanto reduce los efectos secundarios no deseados durante la vacunación. El virus tratado con detergente puede ser inactivado adicionalmente mediante, por ejemplo, un tratamiento con formalina. Algunos ejemplos de estos procedimientos pueden encontrarse en el documento US6.048.573, en el documento US4.522.809, y en el documento WO02/09702. Un inconveniente de esta metodología es que el virus experimenta varias etapas de purificación previas a la etapa de desorganización, y por lo tanto el virus infeccioso vivo es manipulado por el personal de fabricación en varias etapas. Esto supone una preocupación especial cuando se está produciendo una vacuna contra formas especialmente virulentas de la gripe, tales como las cepas H5N1.

El documento WO200035481 desvela la preparación de una vacuna fraccionada contra la gripe a través del

crecimiento en, y la recolección a partir de, embriones de pollo, seguido de la inactivación, la concentración y después el fraccionamiento químico con un tensioactivo no iónico.

A partir del documento Vaccine, vol. 25, 2007, 6028 -6036, se conoce el uso de líneas celulares cultivadas para el crecimiento de virus.

Resumen de la invención Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para producir vacunas víricas con un número reducido de etapas que requieran la manipulación del material infeccioso, produciendo antígenos víricos con una reactividad disminuida.

Por lo tanto la presente invención proporciona un procedimiento para la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos que comprende las etapas a) hasta e) de la reivindicación 1, dando como resultado una preparación que comprende antígenos víricos.

En un segundo aspecto se proporciona un procedimiento para la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos, que comprende las etapas a) hasta d) de la reivindicación 10, dando como resultado una preparación que comprende antígenos víricos.

El procedimiento inventivo proporciona preparaciones de vacuna preparadas a partir de los antígenos víricos producidos según los procedimientos de la invención.

En un aspecto de referencia, la presente memoria descriptiva proporciona el procedimiento de aumentar la resistencia a una infección vírica en un sujeto que comprende la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos, y la administración de dicha preparación a un sujeto.

Breve descripción de los dibujos La Fig. 1a muestra un diagrama de flujo del procedimiento inventivo, desde la recolección del virus tras la propagación hasta la cosecha inactivada.

La Fig. 1b muestra una continuación del diagrama de flujo del procedimiento inventivo, desde la cosecha inactivada hasta la preparación monovalente a granel.

Descripción detallada de la invención Se proporciona un procedimiento para la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos que comprende las etapas a) hasta e) de la reivindicación 1, que da como resultado una preparación que comprende antígenos víricos. Lo fundamental de este procedimiento es que es posible reducir el número de etapas realizadas con un virus activo, y por lo tanto el virus es inactivado después de la recolección de la cosecha primaria previa al tratamiento con detergente y/o las etapas de purificación opcionales.

El "antígeno vírico" de acuerdo con la presente invención es un virus con cubierta o una porción del virus que pueda inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto frente a dicho antígeno. No se requiere un éxito absoluto en el sentido de una inmunización completa del sujeto, pero éste debe entenderse en el sentido de aumentar la defensa inmunitaria o la respuesta inmunitaria frente a dicho virus que reduzca la probabilidad de desarrollar una enfermedad 45 asociada con dicho virus tras una exposición posterior. Dicho antígeno vírico puede ser, por ejemplo, un virus completo inactivado, una fracción vírica, un virus modificado, proteínas víricas, en particular proteínas de superficie, como hemaglutinina o neuraminidasa. En lo que respecta a la invención, ésta se refiere a virus fraccionados. Una "vacuna" es una preparación de dicho antígeno vírico en una forma para su administración, tal como para su administración... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos que comprende a) inoculación de células con virus con cubierta infecciosos en un fluido, en la que dichas células son células primarias o una línea celular cultivada,

b) propagación de dichos virus en dichas células, en la que dichas células están en forma de un cultivo celular, 10 c) recoger dicho virus propagado,

d) inactivar completamente dicho virus recogido directamente después de la recolección del virus antes de cualquier etapa de purificación, y en la que el fluido que contiene el virus o sus constituyentes no víricos no es (son) 15 adicionalmente concentrados antes de dicha etapa de inactivación, y

e) tratar dicho virus inactivado con detergente para producir una vacuna vírica fraccionada, dando como resultado una preparación que comprende antígenos víricos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de recoger dicho virus propagado comprende la separación del virus de las células y/o de los desechos celulares de dichas células después de la infección.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha inactivación se realiza mediante la adición de 25 formaldehído, o se realiza mediante irradiación con UV.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho virus propagado es liberado en dicho fluido.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que después de la recolección, el fluido recogido se trata 30 con una nucleasa.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas células son células de mamífero o de ave.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas células son células epiteliales. 35

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho virus es un virus de la gripe.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración de proteína no vírica durante dicha

inactivación está por debajo de 350 !g/ml. 40

10. Un procedimiento para la elaboración de una preparación que comprende antígenos víricos que comprende a) obtener un fluido que comprende virus con cubierta infecciosos, inoculado en células, en el que dichas células son 45 células primarias o una línea celular cultivada,

b) inactivar dicho virus recogido de la etapa (a) , antes de cualquier etapa de purificación del virus y en el que el fluido que contiene el virus o sus constituyentes no víricos no es (son) adicionalmente concentrados antes de dicha etapa de inactivación,

c) tratar dicho virus inactivado con detergente para producir una vacuna vírica fraccionada, y

d) purificar dicho virus inactivado, dando como resultado una preparación que comprende antígenos víricos.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho fluido se obtiene a partir de un cultivo celular.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente la etapa de estabilizar dichos antígenos víricos.