Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva a partir de semillas de aceituna.

Procedimiento para obtener péptidos con capacidad antihipertensiva mediante digestión enzimática de las proteínas aisladas a partir de la semilla de aceituna.

El método consiste en extraer las proteínas de la semilla de la aceituna utilizando un método desarrollado previamente, disolver el aislado de proteínas en un medio tamponado a pH ligeramente alcalino, digerir con la enzima termolisina, centrifugar y recoger el sobrenadante que contiene péptidos con capacidad antihipertensiva in vitro. Dicha actividad se evalúa mediante el ensayo de inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ACE).

Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva a partir de semillas de aceituna.

La presente invención se refiere a un procedimiento químico basado en el empleo de la enzima termolisina para obtener un extracto peptídico con propiedades antihipertensivas a partir de un asilado de proteínas de semilla de aceituna.

SECTOR DE LA TÉCNICA 10

Esta invención permite obtener substancias con elevado valor añadido a partir de la semilla contenida en el hueso de la aceituna que constituye un residuo generado en el procesamiento de la aceituna. El interés de la invención está en el tratamiento de residuos industriales mediante la obtención de compuestos de alto valor biológico y en la aplicación de los péptidos 15 bioactivos obtenidos. El tratamiento de residuos industriales y la obtención de compuestos de alto valor biológico es de interés para el sector químico y la industria manufacturera de aceituna de mesa y aceite de oliva mientras que, desde el punto de vista de la aplicación de los péptidos encontrados, esta invención iría dirigida al sector alimentario y farmacéutico.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En los procesos de producción de aceitunas de mesa y aceite de oliva se produce un gran volumen de residuos, lo que constituye un problema medioambiental y económico. Concretamente, el hueso de la aceituna forma parte de este material residual que, en general, 25 no se suele aprovechar. Sin embargo, la semilla contenida en el hueso de la aceituna presenta un alto contenido en proteínas, que llegan a representar el 20% del peso, y de donde podrían extraerse moléculas con alto valor añadido como los péptidos bioactivos [1, 2]. De hecho, numerosos estudios han demostrado los beneficios para la salud de algunos péptidos antihipertensivos obtenidos de hidrolizados proteicos de otras semillas como el girasol [3], la 30 quinua [4] y el amaranto [5, 6], pero nunca para el caso de la semilla de la aceituna.

La hipertensión es un importante problema de salud pública en todo el mundo ya que afecta a un cuarto de la población mundial y es un factor de riesgo de accidentes cardiovasculares [7]. Existe en el mercado un gran número de antihipertensivos sintéticos. Sin embargo, estos 35 compuestos sintéticos producir efectos secundarios como tos, alteraciones del gusto o erupciones cutáneas. Por esta razón, los péptidos anithipertensivos procedentes de alimentos o de plantas se han convertido en una interesante alternativa.

En esta patente se propone una alternativa para el aprovechamiento del material residual de la 40 industria aceitunera y la obtención de péptidos antihipertensivos para su empleo en la industria farmacéutica y alimentaria.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El procedimiento químico propuesto permite la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva a partir de semillas de aceituna.

El procedimiento requiere la extracción previa de las proteínas, siguiendo un método previamente optimizado, y su hidrólisis enzimática. La extracción de las proteínas contenidas 50 en el hueso de la aceituna se realiza utilizando un tampón Tris-HCl a pH 7, 5 que contiene dodecilsulfato sódico y ditiotreitol y precipitando las proteínas solubilizadas con acetona. Las proteínas aisladas se disuelven en un medio alcalino y se lleva a cabo la hidrólisis utilizando la enzima termolisina a una temperatura controlada y agitación. Una vez finalizada la digestión, se inactiva la enzima y se separa por centrifugación el sobrenadante que contiene los péptidos con capacidad antihipertensiva.

La evaluación de la capacidad antihipertensiva del extracto peptídico obtenido mediante la digestión con la enzima termolisina de las proteínas contenidas en la semilla de aceitunas de la 5 variedad Arbequina daba como resultado un valor de IC50 (concentración necesaria de péptido para inhibir al 50% la enzima convertidora de la angiotensina, ACE) de 0, 029 ± 0, 009 mg/mL. La obtención de un valor tan bajo de IC50 demuestra que el hidrolizado obtenido constituye una interesante fuente de péptidos con propiedad antihipertensiva.

A través de este procedimiento se describe una alternativa de aprovechamiento de un material residual como son los huesos de aceituna y que hasta ahora no se realizaba. Teniendo en cuenta que la semilla de la aceituna constituye un residuo industrial procedente de los procesos de fabricación de aceitunas de mesa y de aceite de oliva y que su contenido en proteínas es elevado, este procedimiento supone una alternativa muy valiosa para el aprovechamiento de 15 este residuo.

Por último, el procedimiento objeto de la invención es sencillo, económico, rápido y seguro, ya que utiliza instrumentación básica y una enzima comercial de uso extendido en las industrias alimentaria y farmacéutica. 20

MODO DE REALIZACIÓN

Obtención del aislado de proteína de la semilla de aceituna 25

Para la obtención del aislado proteico de la semilla de la aceituna se emplea un método optimizado previamente [8]. Brevemente, el hueso de la aceituna se deja secar a temperatura ambiente y se extrae del mismo la semilla mediante fractura utilizando procedimientos mecánicos. Una vez extraída la semilla de la aceituna esta se tritura en un molinillo. Las proteínas de la semilla se extraen empleando un medio de extracción formado por un tampón 30 Tris-HCl 125 mM (pH 7, 5) que contiene dodecilsulfato de sodio y ditiotreitol. En estas condiciones las proteínas pasan a la disolución acuosa y el residuo sólido se elimina mediante centrifugación. Se recupera el sobrenadante y se le añade acetona previamente enfriada para precipitar las proteínas. El aislado proteico se recoge por centrifugación de la muestra y se deja secar a temperatura ambiente. 35

Obtención del hidrolizado de proteínas de la semilla de aceituna

La hidrólisis del extracto proteico obtenido a partir de la semilla de aceituna se lleva a cabo empleando la enzima proteolítica termolisina. Para ello, el aislado proteico de la semilla de 40 aceituna se disuelve en una disolución reguladora adecuada, como puede ser un tampón fosfato a baja concentración, a un pH comprendido entre 7, 0 y 9, 0. Se recomienda una concentración de a enzima termolisina de 0, 01-0, 5 g enzima/g proteína. La reacción de hidrólisis se lleva a cabo a temperaturas comprendidas entre 40-60 º C durante un tiempo suficientemente elevado como para que la digestión sea completa (superior a 1 h) . 45 Seguidamente se realiza la inactivación de la enzima, que se sugiere que se lleve a cabo calentando las muestras a una temperatura superior a 100 º C. A continuación, se centrifugan las muestras para precipitar las posibles proteínas remanentes. La capacidad antihipertensiva del extracto peptídico obtenido se evalúa a continuación.

Evaluación de la capacidad antihipertensiva

Para evaluar la capacidad antihipertensiva del hidrolizado obtenido con la enzima termolisina se mide la extensión con la que una sustancia es capaz de inhibir la actividad de la enzima ACE [9]. Esta enzima cataliza la reacción de conversión de hipuril-histidil-leucina (HHL) en ácido hipúrico (HA) . Para llevar a cabo el ensayo se prepara una disolución que contiene la enzima ACE en una concentración 0, 05 U/mL y el HHL en una concentración 1, 25 mg/mL en tampón HEPES 50 mM con NaCl 300 mM. La reacción se lleva a cabo mezclando 20 μL de la disolución de enzima ACE con 10 μL de la disolución de HHL, 35 μL de tampón HEPES 50 mM 5 en NaCl 300 mM y 5 μL de muestra o tampón, en el caso del control. Después de la incubación a 37 º C en un baño de agua se para la reacción añadiendo 100 μL de acetonitrilo (ACN) (-20º C) .

La separación y cuantificación de HHL y HA se realiza en un equipo de cromatografía de 10 líquidos de alta eficacia (HPLC) capilar con detección UV empleando una columna cromatográfica C18. Las condiciones cromatográficas son: flujo, 20 μL/min; fases móviles A (ácido acético (AA) al 0, 5% (v/v) en agua) y B (AA al 0, 5% (v/v) en ACN) ; gradiente, 5-100% B en 7 min; vi, 1 μL; temperatura, 25 º C; detección UV a 228 nm. El tratamiento de datos se realiza empleando el programa informático DataAnalysis. 15

La inhibición de la enzima ACE se calcula mediante la ecuación:

Inhibición de ACE (%) = 10000ïï?­ccc

donde c0 representa la concentración de HA cuando no hay inhibición de la enzima ACE, y c es la concentración de HA en presencia del inhibidor de ACE. La actividad inhibidora de los hidrolizados se evalúa mediante el cálculo del valor IC50, que es la concentración requerida de una cierta sustancia para inhibir al 50% la actividad de la enzima ACE.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva a partir de semillas de aceituna caracterizado por las etapas de aislamiento de las proteínas de la semilla, digestión enzimática de las mismas y centrifugación. 5

2. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva, según las reivindicaciones 1, caracterizado porque las proteínas aisladas se disuelven en una disolución reguladora a pHs entre 7, 0 y 9, 0.

3. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva, según las reivindicaciones 1, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas se realiza utilizando la enzima proteolítica termolisina.

4. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad 15 antihipertensiva, según las reivindicación 3, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas requiere una concentración de enzima termolisina comprendida entre 0, 01 y 0, 5 g enzima/g proteína.

5. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad 20 antihipertensiva, según las reivindicación 3, caracterizado porque la digestión enzimática de las proteínas tiene lugar a temperaturas comprendidas entre 40 y 60º C.

6. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva, según la reivindicación 3, caracterizado porque la digestión 25 enzimática de las proteínas se realiza en un tiempo suficiente que asegure el máximo grado de hidrólisis (tiempo de digestión superior a 1 h) .

7. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva, según la reivindicación 3, caracterizado porque finalizada la digestión 30 es necesario la inactivación de la enzima.

8. Procedimiento para la obtención de un extracto peptídico con capacidad antihipertensiva, según la reivindicación 1, caracterizado porque se centrifuga la muestra digerida para separar el sobrenadante que contiene péptidos con capacidad 35 antihipertensiva.