Interacción de Moraxella catarrhalis con células epiteliales, proteínas de la matriz extracelular y el sistema del complemento.

Péptido que consiste en el ID de Secuencia nº 2.

Interacción de Moraxella catarrhalis con células epiteliales, proteínas de la matriz extracelular y el sistema del complemento Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a Moraxella catarrhalis y a su capacidad para interaccionar con las células epiteliales a través de proteínas de la matriz extracelular tales como fibronectina y laminina, y también a su capacidad para inhibir el sistema del complemento. La interacción con estas proteínas extracelulares es útil en la preparación de vacunas.

Técnica anterior

La capacidad de unirse a células epiteliales es de gran importancia para diversas especies bacterianas. Por ejemplo, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes poseen proteínas que se unen a la fibronectina (FnBP) con una organización de secuencia relacionada. Estas FnBP son conocidas como componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas de adhesión de la matriz (MSCRAMMs) . Explotan la estructura modular de la fibronectina formando estructuras en cierre beta, extendidas en tándem en su unión a la fibronectina [27, 39, 47, 73]. La función es mediar en la adhesión bacteriana y en la invasión de las células hospedadoras.

El agente patógeno relevante de la mucosa, Moraxella catarrhalis, es la tercera causa bacteriana principal de otitis media aguda en niños, después de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae [14, 40, 55]. M. catarrhalis es también una de las poblaciones más comunes en la faringe de niños sanos.

Por otra parte, M. catarrhalis también es una causa común de sinusitis y de infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) [74]. El desarrollo de esta especie en pacientes con EPOC está relacionado probablemente en parte a su gran repertorio de adhesinas.

En los últimos años, la investigación se ha enfocado hacia las proteínas de la membrana externa y sus interacciones con el hospedador humano [6, 48, 56]. Algunas de estas proteínas de la membrana externa parecen tener funciones adhesivas que incluyen entre otras, la proteína que se une a IgD de M. catarrhalis (MID, también designada Hag) , la proteína CD, la proteína de adherencia de M. catarrhalis (McaP) y las proteínas de superficie ubicuas (Usp) [1, 22, 33, 48, 61, 81, 84].

Compendio de la invención Debido a que se ha descubierto que M. catarrhalis es una causa principal de infecciones en las vías respiratorias superiores e inferiores, existe una necesidad actual de desarrollar vacunas que se puedan utilizar contra M. catarrhalis.

El objetivo de la presente invención ha sido, por tanto, averiguar en qué manera M. catarrhalis interacciona con las células epiteliales en el organismo y cómo afecta al sistema inmune. De esta manera, se pueden desarrollar sustancias que pueden actuar como vacunas contra M. catarrhalis.

En este estudio, con el uso de mutantes de M. catarrhalis obtenidos a partir de cepas aisladas clínicas, los inventores han sido capaces de mostrar que tanto UspA1 como A2 se unen a la fibronectina y la laminina. Además, los inventores han sido capaces de mostrar que M. catarrhalis interfiere con la vía clásica del sistema del complemento, y también de aclarar de qué manera interfiere.

Muchas bacterias se adhieren a las células epiteliales a través de MSCRAMMs que se unen a fibronectina [54, 77]. Pseudomonas aeruginosa tiene una FnBP que se une a la fibronectina asociada a la célula en células epiteliales nasales [69]. El bloqueo de las interacciones proteicas entre bacterias-fibronectina puede ayudar al tejido del hospedador a superar la infección. De hecho, se ha mostrado que anticuerpos contra una FnBP de S. aureus produjeron una rápida eliminación de las bacterias en ratones infectados [71].

Proteínas UspA1/A2 truncadas recombinantes, junto con fragmentos más pequeños que abarcan toda la molécula, se han sometido a ensayo de acuerdo con la presente invención para estudiar la unión a fibronectina. Tanto UspA1 como A2 se unían a la fibronectina y se encontró que los dominios de unión a la fibronectina estaban localizados dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318. Estas dos proteínas truncadas inhiben la unión de M. catarrhalis a las células epiteliales conjuntivales Chang en un grado similar a los anticuerpos anti-fibronectina. Las observaciones realizadas muestran que tanto UspA1 como A2 de M. catarrhalis están implicadas en la adherencia a las células epiteliales a través de fibronectina asociada a la célula. Por tanto, se sugiere que los sitios biológicamente activos dentro de UspA1299-452 y UspA2165-318, son candidatos potenciales para ser incluidos en una vacuna contra M. catarrhalis.

Además, los inventores han estudiado y caracterizado la unión de M. catarrhalis a laminina. M. catarrhalis es una causa común de agravamientos de la infección en pacientes con EPOC. El desarrollo de esta especie en pacientes con EPOC está probablemente relacionado en parte con su gran repertorio de adhesinas. Además, hay cambios pa

tológicos tales como la pérdida de integridad epitelial con exposición de la membrana basal, en donde la misma capa de laminina está engrosada en los fumadores [4]. Algunos agentes patógenos han mostrado ser capaces de unirse a la laminina y esto puede contribuir a su capacidad para adherirse a tales superficies mucosas dañadas y denudadas. Estos incluyen agentes patógenos conocidos por causar una enfermedad significativa en las vías respiratorias, tales como S. aureus y P. aeruginosa entre otros [7, 63]. Los presentes inventores han sido capaces de mostrar que la proteína de superficie ubicua (Usp) A1 y A2 de M. catarrhalis también se une a la laminina. Los dominios de unión a laminina de UspA1 y A2 se encontraron, entre otros, dentro de las mitades N-terminales de UspA150-491 y UspA230-351. Estos dominios también contienen los dominios de unión a fibronectina. Sin embargo, los fragmentos más pequeños que se unían a fibronectina, UspA1299-452 y UspA2165-318, no se unieron a laminina de una manera apreciable. Fragmentos más pequeños que la mitad N-terminal de UspA1 (UspA150-491) pierden toda su capacidad de unión a la laminina, mientras que con UspA2, solo UspA230-170 se unía a laminina, aunque a un nivel menor que la proteína recombinante completa (UspA230-539) . Estos hallazgos sugieren que diferentes partes de la molécula pueden tener diferentes funciones. Se encontró que UspA150-770 también tenía propiedades de unión a laminina.

Sin embargo, comparando las regiones más pequeñas que se unen a laminina de UspA1 y A2, encontramos que por medio de homología de aminoácidos hay poca similitud entre UspA230-170 y UspA150-491 (datos no mostrados) . Esto no es sorprendente ya que es un hecho conocido que ambas proteínas tienen una estructura de cabeza globular en forma de “piruleta”, a pesar de tener solo un 22% de identidad en ambas mitades N-terminales [2, 32].

Se sugieren como posibles candidatos para ser incluidos en una vacuna contra M. catarrhalis los sitios biológicamente activos dentro de UspA150-770 y UspA230-539 .

Por último, los inventores han estudiado la interacción entre proteínas de la superficie ubicuas A1 y A2 de M. catarrhalis y el sistema inmune innato, y han encontrado que M. catarrhalis interfiere con el sistema del complemento. El sistema del complemento es una de las primeras líneas de defensa innata contra microorganismos patógenos, y la activación de este sistema produce una cascada de depósito de proteínas sobre la superficie bacteriana, lo que da como resultado la formación del complejo de ataque de la membrana o la opsonización del agente patógeno seguida de fagocitosis [85, 86]. Una de las proteínas del complemento más importantes es C3, que está presente en la circulación en una concentración similar a algunas inmunoglobulinas (1-1, 2 mg/ml) . C3 no solo tiene un papel crucial como opsonina, sino que también es el enlace común entre la vía clásica, de lectina y alternativa de la activación del complemento. Las funciones de la vía alternativa, como bucle de amplificación para las vías clásica y de lectina, también se pueden activar de forma espontánea mediante la fijación covalente de C3 a la superficie de un microbio en ausencia de inhibidores del complemento. El depósito de C3 requiere la presencia de un enlace tioéster interno, formado en la proteína natural mediante la proximidad de un grupo sulfhidrilo (Cys1010) y un glutamil carbonilo (Gln1012) en la cadena α de C3 [76]. La escisión proteolítica de un péptido de 77 residuos desde el extremo aminoterminal de la cadena α de C3, genera C3a (anafilatoxina) y C3b. La fijación de C3b se lleva a cabo entonces a través de un enlace covalente entre el grupo... [Seguir leyendo]

1. Péptido que consiste en el ID de Secuencia nº 2.

2. Péptido que consiste en el ID de Secuencia nº 3.

3. Un ligando que comprende un dominio de unión a fibronectina, consistiendo dicho ligando en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en ID de Secuencia nº 2 o ID de Secuencia nº 3.

4. Una proteína de fusión que comprende uno o varios ligandos según la reivindicación 3.

5. Un medicamento que comprende uno o varios ligandos o proteínas de fusión según la reivindicación 3 o 4 y

uno o varios adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, soportes o conservantes farmacéuticamente acepta10 bles.

6. Una vacuna que comprende uno o varios ligandos o proteínas de fusión según la reivindicación 3 o 4 y uno o varios adyuvantes, vehículos, excipientes, aglutinantes, soportes o conservantes farmacéuticamente aceptables.

7. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido, un ligando o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, así como polimorfismos y variantes por corte y empalme de los mismos que 15 tienen actividad de unión a fibronectina.