Inhibidores de varios microARN para usar en la prevención y/o atenuación del envejecimiento cutáneo y/o para hidratar la piel.

Procedimiento in vitro para el cribado de compuestos candidatos para la prevención y/o atenuación del envejecimiento de la piel,

y/o para la hidratación de la piel, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto al menos un compuesto problema con una muestra de queratinocitos;

b. medir la expresión o la actividad de al menos el microARN 130a en dichos queratinocitos;

c. seleccionar los compuestos en los que se mide una inhibición de la expresión de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, o una inhibición de la actividad de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, de dicho microARN en los queratinocitos tratados en (a) en comparación con los queratinocitos sin tratar.

Inhibidores de varios microARN para usar en la prevención y/o atenuación del envejecimiento cutáneo y/o para hidratar la piel

La invención se refiere a la identificación y el uso de compuestos que inhiben la expresión o la actividad de varios 5 microARN para la prevención y/o atenuación del envejecimiento cutáneo, y/o para la hidratación de la piel.

La senescencia celular es una forma de parada irreversible del crecimiento, descrita originalmente para las células en cultivo que se encuentran en la etapa final de la proliferación, pero que se sabe que se estimulan con distintos estímulos, tales como lesiones del ADN, estrés oxidativo, quimioterapia y exceso de los estímulos mitósicos, tales como la activación oncogénica (Serrano et al., 1997; Campisi 2001; Schmitt et al., 2002) . Las células entran en una 10 etapa de parada irreversible y muestran rasgos distintivos, que incluyen la estimulación de la actividad de la βgalactosidasa y el incremento de la expresión de mediadores clave, entre ellos la p53, la proteína de la leucemia promielocítica (PML, por su nombre en inglés) , la p16INK4a y la p19Arf (Serrano et al., 1997, Narita et al., 2003; Sharpless et al., 2004) . Aunque se ha estudiado principalmente in vitro, la senescencia celular mantiene una relación correlativa con el proceso del envejecimiento del animal en su conjunto, con lo que intervienen muchos de los factores que regulan la senescencia y que contribuyen al envejecimiento del organismo (Sharpless y DePinho, 2004, Campisi, 2005) .

Los últimos hallazgos han establecido que la proteína p63, relacionada con la p53, es una molécula clave a la hora de conectar la senescencia y el envejecimiento (Keyers et al., 2005; Sommer et al., 2006) . De hecho, los ratones heterocigotos para p63 tienen una esperanza de vida más pequeña y muestran rasgos de envejecimiento acelerado. 20 Las células que carecen de p63, tanto somáticas como reproductoras, tienen estimulada la expresión de la actividad de la β-galactosidasa, de PML y de p16INK4a, lo que demuestra que la falta de p63 aceleró el fenotipo de envejecimiento (Keyers et al., 2005) . Además de su intervención en el envejecimiento, el factor de transcripción p63 desempeña una función importante en el desarrollo debido a su capacidad para regular la proliferación epitelial, la diferenciación y el destino celular. Los ratones con la p63 genosuprimida muestran varios defectos epiteliales, entre 25 ellos, ausencia de piel, cabello y derivados ectodérmicos (Yang et al., 1999; Mills et al., 1999) . Algunos informes indican que p63 es esencial para mantener la reserva de células madre de la epidermis (Seeno et al., 2007) . Recientemente se ha descrito que p63 está también regulada por varios microARN. En particular, se ha demostrado que miR-203, al actuar selectivamente sobre p63, controla el potencial proliferativo de los queratinocitos de la membrana basal (Lena et al., 2008; Yi et al., 2008) , con lo que controla la transición crucial entre la membrana basal

y la espinosa.

SirT-1 (o Sirt-1) es también una molécula clave que conecta la senescencia y el envejecimiento. Se trata de una desacetilasa dependiente de NAD+ que regula la expresión génica mediante la desacetilación de los restos lisina de las histonas, factores de transcripción y cofactores. Las células con mayor cantidad de SirT-1 mejoran la eficacia metabólica, lo que favorece la longevidad y la resistencia a enfermedades (Haigis M. C. , Guarente L. P. 35 «Mammalian sirtuins-emerging roles in physiology, aging and calorie restriction». Genes Dev. 2006. 1; 20 (21) : 291321) . Además, se sabe que SirT-1 es capaz de proteger frente a la disfunción endotelial al impedir la senescencia inducida por estrés (Potente M, Ghaeni L, Baldessari D, Mostoslavsky R, Rossig L, Dequiedt F, Haendeler J, Mione M, Dejana E, Alt F. W., Zeiher A. M., Dimmeler S. «SIRT1 controls endothelial angiogenic functions during vascular growth». Genes Dev. 2007. 21 (20) : 2644-58) . Se ha demostrado recientemente que SirT-1 está regulada por el

microARN miR-217 en el sistema de senescencia con las células endoteliales (Menghini R, Casagrande V, Cardellini M, Marteli E, Terrinoni A, Amati F, Vasa-Nicotera M, Ippoliti A, Novelli G, Melino G, Lauro R, Federici M. «MicroRNA 217 modulates endothelial cell senescence via silent information regulator 1». Circulation 2009. 120 (15) : 1524-32) .

Se identificó que CDK6 era un nuevo miembro de una familia de cinasas relacionadas con la cdc-2 de los vertebrados. Esta nueva cinasa se encontró que era la pareja de las ciclinas de tipo D y que poseía actividad cinasa 45 sobre pRb in vitro, y desde entonces se ha sabido que funciona únicamente como una cinasa de pRb (retinoblastoma) en la regulación de la fase G (1) del ciclo celular. En los últimos dos años, varios estudios independientes en varios tipos celulares han indicado que cdk6 tiene una nueva función en la diferenciación. No se conoce el mecanismo por el que cdk6 interviene en la diferenciación, pero puede extenderse más allá de la función establecida de que cdk6 es una cinasa de pRb. A medida que esta historia avance, será importante descubrir si la 50 función de cdk6 en la diferenciación es dependiente de pRb o es independiente de pRb, ya que se ha establecido hace tiempo que pRb es un factor clave para el inicio y el mantenimiento de la salida del ciclo celular durante la diferenciación (Kohrt D. M. et al., Cycle. 2009, 1; 8 (17) : 2837-43; Grossel M. J., et al., J. Cell Biochem. 2006; 97 (3) : 485-93) . Nunca antes se había descrito que cdk6 estuviera implicada en la senescencia.

Los microARN (miR) son moléculas de ARN monocatenario que regulan la expresión del ARNm mensajero. Los miR

se sintetizan como transcritos de pre-microARN que se transportan al citoplasma, donde sufren la escisión por Dicer, una enzima de tipo ribonucleasa III. En los mamíferos, Dicer desempeña funciones importantes en la diferenciación celular y en la morfogenia del tejido, y la desaparición de Dicer en los ratones induce mortalidad embrionaria en la etapa del desarrollo E6-E7 (Bernstein et al., 2003) . La eliminación de Dicer en los fibroblastos embrionarios induce un fenotipo de senescencia prematura que también se ha observado in vivo después de la eliminación de Dicer de las extremidades en desarrollo y de la piel adulta (Mudhasani et al., 2008) . Los miR maduros regulan negativamente la expresión génica al actuar selectivamente sobre ARNm mensajeros específicos para escindirlos o para reprimir su traducción. Cada vez hay más datos que sugieren que están implicados en el control de un amplio abanico de vías fisiológicas, entre ellas la senescencia celular.

Así pues, es deseable e importante dar a conocer productos o agentes activos que previenen, reducen o incluso inhiben la senescencia celular, en particular la senescencia de los queratinocitos.

Así pues, la presente invención da a conocer un procedimiento para identificar tales agentes útiles.

La presente invención está relacionada, por lo tanto, con un procedimiento in vitro de cribado de compuestos 10 candidatos por su capacidad para prevenir y/o atenuar el envejecimiento de la piel, y/o para hidratar la piel, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto al menos un compuesto problema con una muestra de queratinocitos;

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN en dichos queratinocitos;

c. seleccionar los compuestos en los que se mide una inhibición de la expresión de al menos el 20%,

15 preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, o una inhibición de la actividad

de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, de al menos

un microARN en los queratinocitos tratados en (a) en comparación con los queratinocitos sin tratar.

Preferiblemente, los queratinocitos son queratinocitos presenescentes. Así pues, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la detección de compuestos candidatos capaces de prevenir y/o atenuar el 20 envejecimiento de la piel, y/o para hidratar la piel, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto al menos un compuesto problema con una muestra de queratinocitos presenescentes;

b. medir la expresión o la actividad de al menos un microARN en dichos queratinocitos presenescentes;

c. seleccionar los compuestos en los que se mide una inhibición de la expresión de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, o una inhibición de la actividad

de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, de al menos un microARN en los queratinocitos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para el cribado de compuestos candidatos para la prevención y/o atenuación del envejecimiento de la piel, y/o para la hidratación de la piel, que comprende las etapas siguientes:

a. poner en contacto al menos un compuesto problema con una muestra de queratinocitos;

b. medir la expresión o la actividad de al menos el microARN 130a en dichos queratinocitos;

c. seleccionar los compuestos en los que se mide una inhibición de la expresión de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, o una inhibición de la actividad de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, de dicho microARN en los queratinocitos tratados en (a) en comparación con los queratinocitos sin tratar.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa (b) se realiza antes y después de la etapa (a) .

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

a'. preparar al menos dos muestras de queratinocitos;

a. poner en contacto una de las muestras con al menos un compuesto problema; luego b. medir la expresión o la actividad de al menos el microARN 130a en dichas muestras; y

c. seleccionar los compuestos en los que se mide una inhibición de la expresión de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, o una inhibición de la actividad de al menos el 20%, preferiblemente de al menos el 30%, preferiblemente de al menos el 40%, de dicho microARN en los queratinocitos tratados en (a) en comparación con la muestra de queratinocitos sin tratar.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dichos queratinocitos son queratinocitos presenescentes.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el microARN actúa selectivamente sobre el ARNm de p63 o sobre el gen TP63.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado por que los

queratinocitos presenescentes se obtienen después de las 37 duplicaciones de la población en las condiciones clásicas de cultivo.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que las condiciones clásicas de cultivo comprenden un cultivo de los queratinocitos en el medio 154 con complementos de crecimiento HKGS, y se mantiene constantemente en un estado de subconfluencia.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que los compuestos problema se eligen de extractos botánicos.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la inhibición de la expresión o la actividad del microARN medida en la etapa (c) es de al menos el 50%, preferiblemente de al menos el 60%.

10. Uso cosmético de un anti-miR-130a, para la prevención y/o atenuación del envejecimiento de la piel y/o para la hidratación de la piel.