Procedimiento para inducir proliferación de hepatocitos y usos del mismo.

Un uso de un agonista del receptor de la adenosina A3 (agonista de A3AR) para estimular la proliferación de hepatocitos in vitro.

Procedimiento para inducir proliferación de hepatocitos y usos del mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la terapéutica y, en particular, a procedimientos para producir diferenciación de hepatocitos y regeneración hepática.

Técnica anterior

La siguiente es una lista de la técnica que se considera pertinente para describir el estado de la técnica en el campo de la invención. El reconocimiento de estas referencias en el presente documento en ocasiones se realizará indicando su número entre paréntesis de las lista siguiente.

1. 1. Henrion J. Ischemia/reperfusion ¡njury of the liver: pathophysioloic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta Gastroenterol Belg. 63:336-347.

2. 2. Shirasugi N, Wakabayashi G, Shimazu M. Up-regulation of oxygen-derived free radicáis by ¡nterleukin-1 in hepatic ischemia/reperfusion ¡njury. Transplantation 64:1398-43.

3. 3. Xu Z, Jang Y, Mueller RA, Norfleet EA: IB-MECA and cardioprotection. Cardiovasc. Drug Rev. 24(3- 4):227-238.

4. 4. Chen GJ, Harvey BK, Shen H, Chou J, Víctor A, Wang Y: Activation of adenosine A3 receptors reduces ischemic brain injury in rodents. J. Neurosci. Res. 84(8): 1848-1855.

5. 5. Fishman P, Bar-Yehuda S, Farbstein T, Barer F, Ohana G: Adenosine acts as a chemoprotective agent by stimulating G-CSF production: a role for A1 and A3 adenosine receptors. J. Cell. Physiol. 183(3):393-398.

6. 6. Fishman P, Bar-Yehuda S, Barer F, Madi L, Multani AF, Pathak S: The A3 adenosine receptor as a new target for cáncer therapy and chemoprotection. Exp. Cell. Res. 269(2): 23-236.

7. 7. Bar-Yehuda S, Madi L, Barak D et al.: Agonists to the A3 adenosine receptor induce G-CSF production vía NF-kappaB activation: a new class of myeloprotective agents. Exp. Hematol. 3(12): 139-1398.

8. 8. Fishman P, Bar-Yehuda S, and Wagman L. (1998). Adenosine and other low molecular weight factors released by muscle cells inhibit tumor cell growth: Possible explanation for the rarity of metastases in muscle. Cáncer Res. 58:3181-3187.

9. 9. Fishman P, Bar-Yehuda S, Farbstein T, Barer F, and Ohana G. Adenosine acts as a chemoprotective agent by stimulating G-CSF production: A role for AI& A3 adenosine receptors. J. Cell. Physiol. 183:393-398.

1. 1. Fishman P, Bar-Yehuda S, Barer F, Madi L, Multani Asha S, Pathak S. The A3 adenosine receptor as a new target for cáncer therapy and chemoprotection. Exp Cell Res. 269:23-236.

11. 11. Teoh N, déla Pena A, Farrell G. Hepatic ischemia preconditioning in mice is associated with activation of NFKB. p38 kinase and cell cycle entry. Hepatology 36:94-12.

Antecedentes de la invención

El hígado es el único órgano vital, aparte del cerebro, para el que no hay un medio de soporte farmacológico, mecánico o extra-corpóreo adicional para cuando falla el órgano, tales como los que se encuentran para los pulmones, riñones y corazón. El hígado es también único en cuanto a que es el único órgano de mamíferos que puede regenerar su masa parenquimatosa biológicamente funcional tras resección o lesión, en lugar de curarse con tejido cicatricial biológicamente no funcional.

Las resecciones hepáticas han sido cada vez más seguras durante los últimos 1 años debido a las mejoras en el diagnóstico preoperatorio, técnicas quirúrgicas y cuidados postoperatorios. La mortalidad postoperatoria se correlaciona directamente con la función hepática preoperatorio y el volumen de hígado resecado. La función del hígado restante se recupera rápidamente en pacientes con el parénquima hepático normal, ya que los hepatocitos proliferan para restaurar la pérdida de volumen. No obstante, en presencia de hepatopatía parenquimatosa, como en pacientes con cirrosis hepática, esteatosis hepática grave o metástasis hepática colorrectal, debilitado por la quimioterapia neoadyuvante antes de la resección hepática, la proliferación hepatocelular está alterada, exponiendo a los pacientes a disfunción hepática y complicaciones asociadas que culminan en insuficiencia hepática posthepatectomía, que tiene una mortalidad elevada (6-9 %).

Se han identificado varias vías en la regeneración hepática, incluyendo una vía de citocinas que es en gran medida responsable de la entrada de los hepatocitos en el ciclo celular (transición de G a G1), un proceso que se

denomina cebado, y una vía del factor de crecimiento que es responsable de la progresión del ciclo celular (fase G1 a la fase S).

Además, la lesión por repercusión isquémica del hígado es otra manifestación conocida y clínicamente significativa de procedimientos quirúrgicos, tales como transplante hepático y resección hepática parcial (1). Existen dos fases distintas de lesión hepática tras la lesión por repercusión de isquemia. La fase Inicial (< 2 horas después de la repercusión) se caracteriza por tensión oxldatlva, en la que la producción y liberación de especies de oxígeno reactivo (ROS) parece dar como resultado directamente lesión hepatocelular. La fase tardía (6-48 h después de la repercusión) es un trastorno Inflamatorio mediado por los neutrófilos reclutados. Las interrelaciones entre productos de células de Kupffer activadas y neutrófilos, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina (IL)-1, óxido nítrico (NO) y leucotrienos, se han implicado en la patogenia de la lesión por reperfusión de isquemia hepática (2). Los efectos biológicos de TNF-a se extienden desde inducir muerte celular a estimular la regeneración celular.

De hecho, en estudios recientes se ha mostrado que el preacondicionamiento isquémico se puede asociar con la entrada de los hepatocitos en el ciclo celular en un plazo de 2 horas de la posterior repercusión de la isquemia en un modelo murino de lesión IR hepática parcial (11),

La adenosina, a través de su unión a los receptores selectivos de membrana asociados a proteína G, designados A-i, A2A, A2B y A3, se acumula extracelularmente tras la isquemia y se sabe que confiere citoprotección. En particular, se ha hallado que el A3AR está Implicado en la mediación de la protección cardiológica-neurológica y química (3-7).

El receptor de adenosina A3, un receptor de superficie celular asociado con la proteína G¡, se ha propuesto como diana para combatir el cáncer y la Inflamación. El receptor se expresa considerablemente en varios tipos de células tumorales, mientras que se mostró expresión baja en tejidos normales adyacentes. En estudios in vivo se ha mostrado que los agonistas de A3AR Inhiben el desarrollo de carcinomas de colon, próstata y páncreas, así como melanoma y hepatoma.

También se ha demostrado que los agonistas de AsAR actúan como agentes antiinflamatorios mejorando el proceso de Inflamación en diferentes modelos de autolnmunidad experimental, tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple y enfermedad de Crohn.

Además, se ha demostrado que los agonistas de A3AR poseen un efecto diferencial sobre el crecimiento de células tumorales y normales. Aunque la activación de A3AR inhibe el crecimiento de varias líneas de células tumorales, estimula la proliferación de células normales tales como células de la médula ósea (8-1).

En la actualidad no existe una intervención farmacológica demostrada que atenúe la lesión de células hepáticas o que aumente la regeneración tisular del hígado después de una lesión aguda o crónica de este órgano vital.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en los hallazgos siguientes obtenidos de experimentos realizados en ratas con CI-IB- MECA, un agonista de A3AR específico y selectivo:

el tratamiento con CI-IB-MECA indujo la proliferación de los hepatocitos tras hepatectomía parcial;

el tratamiento con CI-IB-MECA redujo los niveles séricos de las enzimas hepáticas alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) tras hepatectomía parcial;

el tratamiento con Cl-IB-MECA aumentó el número de hepatocitos que sufren mitosls tras hepatectomía parcial;

el tratamiento con CI-IB-MECA aumentó el número de células positivas al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) (correlacionándose la expresión con el grado de proliferación celular);

el tratamiento con CI-IB-MECA aumentó el peso del hígado.

En base a los hallazgos anteriores, se ha concluido que los agonistas de A3AR se pueden usar para inducir proliferación de hepatocitos y regeneración hepática.

Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un procedimiento de estimulación de la proliferación de los hepatocitos que comprende poner en contacto los hepatocitos... [Seguir leyendo]

1. Un uso de un agonista del receptor de la adenosina A3 (agonista de A3AR) para estimular la proliferación de hepatocitos in vitro.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el agonista de A3AR es un derivado de purina que entra dentro del alcance 5 de la fórmula general (I);

r3

a»

R2

Ri

en la que Ri es alquilo C1-C1, hidroxialquilo C1-C1,, carboxialquilo C1-C1 o cianoalquilo C1-C1 o un grupo de la fórmula general (II) siguiente.

(II)

en la que:

- Y es un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o CH2;

X1 es hidrógeno, alquilo C1-C1, RaRbNC(=)- o HORc-, en donde Ra y Rb pueden ser ¡guales o diferentes y se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1-C1, amino, haloalquilo C1-C1, aminoalquilo C1-C1, amlnoalquilo C1-C1 BOC y cicloalquilo C3-Cio o se unen para formar un anillo heterocíclico que contiene de dos a cinco átomos de carbono, y 15 Rc se selecciona de alquilo C1-C1, amino, haloalquilo C1-C1, aminoalquilo C1-C1, amlnoalquilo C1-C1 BOC y cicloalquilo C3-Cio;

- X2 es hidrógeno, hidroxilo, alquilamino C1-C1, alqullamido C1-C1 o hidroxialquilo C1-C1;

- Xb y X4 son, cada uno de forma independiente, hidrógeno, hidroxilo, amino, amido, azido, halo, alquilo, alcoxi, carboxi, nitrilo, nitro, trifluoro, arilo, alcarilo, tio, tioéster, tioéter , -OCOPh, -OC(=S)OPh o X3 e X4 son oxígeno

conectado >C=S para formar un anillo de 5 miembros, o X2 y Xs forman el anillo de fórmula (III):

(III)

donde R' y R" son de forma independiente alquilo C1-C1;

- R2 se selecciona de hidrógeno, halo, alquiléter C1-C1, amino, hidrazido, alquilamino C1-C1, alcoxi C1-C1, tioalcoxi C1-C1, piridiltio, alquenilo C2-C1; alquinilo C2-C1, tio y alquiltio C1-C1; y

- R3 es un grupo-NR4Rs siendo R4 hidrógeno o un grupo seleccionado de alquilo, alquilo sustituido o aril-NH-C(Z)-,

siendo Z O, S o NRa, y

- donde R4 es hidrógeno, siendo R5 seleccionado de grupos R- y S-1-feniletilo, bencilo, feniletilo o anilida, estando cada unode dichos grupos sin sustituir o sustituido en una o más posiciones con un sustituyente seleccionado de alquilo C1-C1, amino, halo, haloalquilo C1-C1, nitro, hidroxilo, acetoamido, alcoxi C1-C1 y ácido sulfónico o una sal del mismo; o R5 es benzodioxanometilo, fururilo, L-propilalanil-aminobencilo, 13-alanilmino-bencilo, T-BOC-I3- alanilaminobencilo, fenilamino, carbamoílo, fenoxi o cicloalquilo C1-C1; o R5 es un grupo de la siguiente fórmula (IV):

(IV)

o, cuando R4es alquilo, alquilo sustituido o aril-NH-C(Z)-, Rsse selecciona del grupo que consiste en heteroaril-NRa- C(Z)-, heteroaril-C(Z)-, alcaril-NRa-C(Z)-, alcaril-C(Z)-, aril-NR-C(Z)- y aril-C(Z)- sustituidos o no sustituidos; o el agonista de A3AR es un derivado de xantina-7-ribósido de la fórmula general (V) siguiente:

Rr

OH OH

en la que:

- X es O o S;

- R6 es RaRbNC(=)- o HORc-, en la que

- Ra y Rb pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan de hidrógeno, alquilo C1-C1, amino, haloalquilo C1-C1, aminoalquilo C1-C1 y cicloalquilo C3-C1, o están unidos para formar un anillo heterocíclico que contiene de dos a cinco átomos de carbono; y

- Rc se selecciona de alquilo C1-C1, amino, haloalquilo C1-C1, aminoalquilo C1-C1 , aminoalquilo C1-C1 BOC y cicloalquilo C3-C1;

- R7 y Rs pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan de alquilo C1-C1, cicloalquilo C1-C1, R- o S-1-feniletilo, un grupo bencilo o anilida sin sustituir y un feniléter del grupo bencilo sustituido en una o más posiciones con un sustituyente seleccionado de alquilo C1-C1, amino, halo, haloalquilo C1-C1, nitro, hidroxilo, acetamido, alcoxi C1-C1 y ácido sulfónico;

- R9 se selecciona del grupo que consiste en halo, bencilo, fenilo, cicloalquilo C3-C1 y alcoxi C1-C1; o una sal adecuada del compuesto definido anteriormente.

3. El uso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el agonista de A3AR es un derivado de N6-benciladenosin-5'- uronamida seleccionado del grupo que consiste en N6-2-(4-aminofenil)etiladenosina (APNEA), N6-(4-amino-3- yodobencil) adenosina-5'-(N-metiluronamida) (AB-MECA), 1-desoxi-1-{6- [({3-yodofenil} metil)amino]-9H-purin-9-il}- N-metil- li-D-ribofuranuronamida (IB-MECA) y 2-cloro-N6-(3-yodobencil)adenosin-5'-N-metiluronamida (CI-IB-MECA).

4. El uso de la reivindicación 3, en el que el agonista de A3AR es IB-MECA o CI-IB-MECA.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que el agonista de A3AR es CI-IB-MECA.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para inducir proliferación de hepatocitos en el hígado tras un daño hepático o un daño inducido por enfermedad.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que el daño hepático o el daño inducido por enfermedad son un resultado de hepatectomía, cirrosis del hígado, neoplasias malignas hepáticas, exposición a alcohol, fármacos hepatotóxicos y combinaciones de los mismos, agentes infecciosos, los efectos secundarios de la terapia génica, exposición a agentes anti-tuberculosis y agentes quimioterapéuticos o sobredosis de acetaminofén (APAP).

8. Un agonista de A3AR para usar en un procedimiento in vivo para estimular la proliferación de hepatocitos en un

sujeto.

9. El agonista de A3AR para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el sujeto tiene daño hepático o enfermedad hepática inducida con fármacos.

1. El agonista de A3AR para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el daño hepático o la enfermedad 1 hepática inducida con fármacos son un resultado de hepatectomía, cirrosis del hígado, neoplasias malignas

hepáticas, exposición a alcohol, fármacos hepatotóxicos y combinaciones de los mismos, agentes infecciosos, los efectos secundarios de la terapia génica, exposición a agentes anti-tuberculosis y agentes quimioterapéuticos o sobredosis de acetaminofén (APAP).

11. Un agonista de A3AR para uso en un procedimiento para tratar el daño hepático en un paciente que tiene daños 15 hepáticos debido a hepatectomía.

12. El agonista de A3AR para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2-5.