Identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en tiempo real.

Un método para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénico que comprende:

a) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno o más de los 13 genotipos de VPH de alto riesgo en la muestra; en la que los cebadores usados en la etapa a) tienen las secuencias SEC ID Nº: 1-8;

b) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han demostrado ser positivas en la exploración de primera línea:

- ensayos de PCR en tiempo Real TaqMan independientes para determinar la presencia de la carga viral de los tipos de VPH oncogénicos más comunes:

tipos de VPH: 16, 18, 31, 45, grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 58, 67) en los que los cebadores usados en el ensayo de PCR en Tiempo Real TaqMan tienen las secuencias SEC ID 3, 4, 7, 8, 21-31,

- 6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58 en el que los cebadores usados en el ensayo de PCR en tiempo Real de SYBR Green en la etapa b tienen las secuencias SEC ID 9-20.

Identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en tiempo real

La presente invención se refiere a la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénicos por medio de ensayos de PCR en Tiempo Real.

Antecedentes de la invención En años recientes se ha establecido que la infección por papilomavirus humano oncogénico (VPH) es una condición necesaria para la carcinogénesis del cuello uterino (Zur Hausen, 2002) . Los tipos de VPH de alto riesgo más frecuentes son VPH 16, -18, -31, -33, -45 y -58. Se considera que la infección persistente es el verdadero precursor de la progresión neoplásica (Kjaer et al., 2002) . En la actualidad, sin embargo, las infecciones por VPH se controlan principalmente por los ensayos de detección de ADN de VPH cuantitativos que son frecuentemente no específicos de tipo y por lo tanto en el tratamiento clínico de los pacientes no distinguen entre infecciones persistentes y transitorias, siendo estas últimas extremadamente frecuentes en mujeres sexualmente activas. La detección viral no específica cualitativa representa por lo tanto un medio ineficaz de identificar mujeres en riesgo de desarrollar cáncer del cuello uterino (Ho et al, 1998; Jacobs et al, 2000) . Existe por lo tanto la necesidad de establecer un marcador clínico adecuado capaz de distinguir infección persistente de transitoria para identificar mejor a las mujeres en riesgo de progresión neoplásica. Por lo tanto, la detección de VPH y técnicas de tipificación se han propuesto como un accesorio de, o un reemplazo para, el régimen de exploración citológica actual. Claramente el éxito de dichas estrategias dependerá del desarrollo de métodos de detección de VPH rápidos, fiables, sensibles y específicos aplicables en la situación clínica. Se ha propuesto la carga viral de VPH como un marcador sustituto de infección persistente (Ho et al, 1998) pero su uso en la identificación de mujeres en riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino (CC) sigue siendo controvertido (Josefsson et al, 2000; Lorincz et al, 2002; Dalstein et al, 2003; Gravitt et al, 2003; Moberg et al, 2004) .

Se han desarrollado pocos ensayos de PCR cualitativos fiables para la medición de la carga de VPH y esto podría explicar la discrepancia en los resultados obtenidos en estudios previos. La falta de normalización de los métodos usados, particularmente la secuencia de VPH elegida para amplificar y el modo en que se determina el número de células por muestra, puede ser responsable de los resultados controvertidos (Moberg et al. 2004) . Hay un gran interés en el uso de ensayos de VPH cuantitativos validados en estudios epidemiológicos para definir mejor la evolución de la infección por VPH y la progresión de la lesión. Se han desarrollado varios ensayos de PCR en tiempo real para medir la carga de ADN de VPH-16 ajustando la señal obtenida para ADN de VPH-16 con la cantidad de ADN celular calculado a partir de la amplificación de un gen humano (Swan et al., 1997, 1999; Josefsson et al., 1999, 2000; Ylitalo et al., 2000; Peitsaro et al., 2002; Nagao et al., 2002; Beskow y Gyllensten, 2002) . Además de la carga viral, también se sabe que el estado de integración del genoma de VPH tiene implicaciones profundas para el pronóstico de pacientes. Sin embargo, aún no está claro si la carga viral o el estado de integración del VPH es un factor de riesgo para la progresión del cáncer del cuello uterino debido a resultados conflictivos obtenidos usando diferentes metodologías en estudios previos.

Además, varios estudios han mostrado que en la carcinogénesis del cuello uterino, se requiere la expresión de VPH de transcritos del oncogén E6 y E7 específicos para transformación e inmortalización celular. Además, se ha descubierto que la presencia de E6 y E7 aumenta con el aumento de la gravedad de la enfermedad del cuello uterino (Kraus et al., 2004, Molden et al 2005) . En consecuencia, la expresión persistente de estos oncogenes puede actuar como un indicador de progresión a lesiones precursoras neoplásicas y cáncer invasivo (Sotlar et al., 1998) . La detección de ARNm de E6 y E7 puede por lo tanto ser una herramienta válida adicional accesoria a la carga de ADN viral para identificar pacientes que tengan más probabilidad de experimentar progresión de enfermedad. Existe en la actualidad un ensayo de VPH disponible en el mercado, PreTect® VPH-Proofer (NorChip) , que detecta transcritos de ARNm E6/E7 para VPH 16, 18, 31, 33 y 45 usando el método de NASBA (Molden et al 2007) . Los datos iniciales, sobre el valor de pronóstico y especificidad de este método para enfermedad subyacente son prometedores (Kraus et al., 2004, Cuschieri et al., 2004, Molden et al 2005) pero el valor clínico de este método en comparación con la cuantificación de ensayos de ADN de VPH aún debe determinarse.

Se desvela un método de PCR en tiempo real para la determinación cuantitativa y cualitativa de VPH oncogénico para predecir el riesgo de infección por VPH que da como resultado carcinoma del cuello uterino en Gyllesten et al, documento WO 2004/031416 A. El método permite estimar la carga viral para la serie de tipos de VPH más frecuentemente hallados en diferentes grados de neoplasia del cuello uterino y tumores. La determinación de especie individual se realiza usando cebadores específicos para los transcritos de E6/E7 oncogénicos de los tipos de VPH. Se desvela un enfoque de PCR en Tiempo Real múltiple por el que pueden identificarse virus de hepatitis B por medio del colorante Sybr Green I en Sun Zhen et al, Genomics, 89 (1) , 151-159, 2007.

Finalmente un mejor entendimiento de los genotipos de VPH en circulación en áreas geográficas diferentes se ha vuelto muy importante, particularmente a la vista de la reciente introducción de vacunas de VPH bivalentes (tipos 16 y 18) . Será de hecho necesario continuar con programas de exploración particularmente en áreas en las que se ha

descubierto que son prevalentes otros genotipos oncogénicos, ya que la inmunización protegerá solamente contra los tipos de VPH a los que se dirige la vacuna (Roden 2006 revisión) .

Descripción de la invención La presente invención proporciona un sistema que permite detectar uno o más genotipos de VPH de alto riesgo en muestras clínicas y determinar la actividad oncogénica viral por medio tanto de carga de ADN específica como de presencia de ARNm de E6/E7.

El sistema minimiza el número de reacciones paralelas realizadas para cada muestra y lo hace adecuado para su uso en exploración rutinaria de muestras de ensayo biológicas tales como muestras citológicas del cuello uterino, sangre periférica, orina, biopsias tisulares y similares.

La invención proporciona más particularmente un método para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos 15 de VPH oncogénico por medio de ensayos de PCR en tiempo real que comprenden:

1) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno más de 13 genotipos de VPH de alto riesgo en la muestra;

2) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han dado resultado positivo en la exploración de primera línea, incluyendo:

- ensayos de PCR en tiempo Real de TaqMan independientes para determinar la presencia y la carga viral de los tipos de VPH oncogénicos más comunes: 16, 18, 31, 45, grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 25 58, 67) . -6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58.

Descripción detallada de la invención La invención proporciona un método para identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénico que comprende:

a) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I

independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno o más de 13 genotipos de VPH de alto riesgo en muestras clínicas; b) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han dado resultado positivo a la exploración de primera línea, incluyendo:

i) 5 ensayos de PCR en tiempo Real de TaqMan independientes para determinar la presencia y la carga viral de los tipos de VPH oncogénico más comunes: 16, 18, 31, 45 y grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 58, 67) . ii) 6 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58.

Se conocen ensayos... [Seguir leyendo]

1. Un método para la identificación y cuantificación de ácidos nucleicos de VPH oncogénico que comprende:

a) exploración de primera línea por medio de 5 ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I independientes para determinar la carga viral total y para identificar la presencia de uno o más de los 13 genotipos de VPH de alto riesgo en la muestra; en la que los cebadores usados en la etapa a) tienen las secuencias SEC ID Nº : 1-8; b) ensayos de segunda línea para aplicar a muestras que han demostrado ser positivas en la exploración de primera línea:

- ensayos de PCR en tiempo Real TaqMan independientes para determinar la presencia de la carga viral de los tipos de VPH oncogénicos más comunes:

tipos de VPH: 16, 18, 31, 45, grupo 33 (que incluye los genotipos 33, 52, 58, 67) en los que los cebadores usados en el ensayo de PCR en Tiempo Real TaqMan tienen las secuencias SEC ID 3, 4, 7, 8.

2. 31,

- ensayos de PCR en tiempo Real de SYBR Green I RT independientes para determinar la presencia en la 20 muestra de los transcritos oncogénicos E6/E7 de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 45, 58

en el que los cebadores usados en el ensayo de PCR en tiempo Real de SYBR Green en la etapa b tienen las secuencias SEC ID 9-20.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicha muestra puede ser cualquier muestra de ensayo biológica tal como muestras citológicas del cuello uterino, sangre periférica, orina, biopsias tisulares y similares.

3. Un kit para realizar los métodos de las reivindicaciones 1 o 2 que incluye los cebadores de la reivindicación 1 y

tampones, sondas y marcadores adecuados. 30