Identificación de nuevas toxinas antagonistas de canales de calcio de tipo T de aplicación analgésica.

Péptido de secuencia aminoacídica

YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1).

Identificación de nuevas toxinas antagonistas de canales de calcio de tipo T de aplicación analgésica Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a una toxina antagonista de canales de calcio de tipo T ("canales de tipo T") . En particular, se refiere a un péptido compuesto por un péptido, a ácidos nucleicos que codifican este péptido y al uso de dicho péptido como antagonista y/o agonista inverso de canales de calcio de tipo T. La presente invención se refiere igualmente al uso de este péptido para la fabricación de un medicamento.

Encuentra aplicación especialmente en el tratamiento del dolor, en patologías cardiovasculares, en el tratamiento de la disfunción eréctil y potencialmente en el tratamiento de cánceres.

En la descripción siguiente, las referencias indicadas como " Ref. " remiten a la lista de referencias presentadas después de los ejemplos.

Estado de la técnica La toma en consideración y el tratamiento del dolor son esenciales para la calidad de vida. El dolor afecta a un número significativo de personas. En Europa, se estima que 60 millones de personas están afectadas cada año por el dolor, lo que representa un coste anual de 1.000 millones de dólares en medicamentos para su tratamiento. Los gastos efectuados anualmente en medicamentos analgésicos pueden evaluarse en aproximadamente 25.000 millones de dólares y deberían alcanzar los 42.000 millones en 2010. El dolor se divide en dos categorías: el dolor agudo y el dolor crónico. El dolor agudo corresponde a un dolor rápido y breve, limitado en el tiempo, en contraposición con el dolor crónico, que es un dolor persistente y que puede estar ligado, por ejemplo, a una hiperalgesia.

Se han efectuado numerosos estudios referentes a la identificación de los mecanismos que permiten la transmisión del dolor. La transmisión de la señal de dolor por el sistema nervioso hace intervenir a receptores neuronales que transforman el estímulo doloroso en una señal eléctrica. Esta se transmitirá entonces al sistema nervioso central por los nervios, haciendo intervenir a receptores moleculares específicos.

Entre las diversas neuronas sensoriales, se pueden citar las neuronas nociceptivas, que reaccionan específicamente a los estímulos dolorosos.

A causa de su especificidad, las neuronas nociceptivas poseen un repertorio único de canales iónicos, que son proteínas responsables de la excitabilidad celular, y que representan una clase importante de dianas de medicamentos. Así, los canales iónicos expresados específicamente en las neuronas nociceptivas representan también dianas para el descubrimiento de nuevos analgésicos.

Las moléculas que inhiben el dolor, o analgésicos, son conocidas desde hace mucho tiempo. Se pueden citar, por ejemplo, la clase de los opiáceos, que actúan sobre la señalización de la señal de dolor y estimulan las vías nerviosas inhibidoras del dolor. Se usan otras moléculas para tratar los dolores crónicos. Son, por ejemplo, moléculas que actúan sobre los receptores de GABA como badofeno, diazepám, tizanidina y dartroleno.

Las moléculas analgésicas usadas actualmente presentan varios inconvenientes. Es bien conocido que los derivados de los opioides pueden provocar fenómenos alucinatorios y depresiones cardiorrespiratorias. Son igualmente fuente de dependencias, como por ejemplo dependencia de morfina, metadona, etc. Por último, el tratamiento con opiáceos está asociado a efectos indeseables como un estreñimiento grave.

Existen igualmente casos de habituación de estos medicamentos, es decir, que deba aumentarse la dosis necesaria para obtener un efecto constante. Esta habituación crece con el tiempo y conlleva por tanto la necesidad de aumentar las dosis y puede conllevar la ineficacia del medicamento. Efectivamente, la cantidad necesaria puede volverse superior a la dosis tóxica de dicho medicamento.

Por ejemplo, en el caso de dolores neuropáticos, que pueden aparecer en casos de diabetes, cáncer, tratamientos quimioterapéuticos, dolores inflamatorios crónicos, casos de síndrome del colon irritable, etc., el tratamiento del dolor con analgésicos y antálgicos conocidos induce frecuentemente un fenómeno de habituación y por tanto problemas de tratamiento de estos dolores.

Existe por tanto una necesidad real de encontrar nuevas moléculas analgésicas o antálgicas que palien estos defectos, inconvenientes y obstáculos de la técnica anterior con el fin de reducir los costes y mejorar el tratamiento del dolor y el bienestar de los pacientes.

Exposición de la invención Los inventores han mostrado mediante experimentos de inhibición de la expresión del gen Cacna1h, que codifica el canal de calcio de tipo T Cav3.2 presente en los nocirreceptores, que dicho canal está implicado en la percepción del dolor.

Los canales Cav3.2 forman parte de la familia de los canales de calcio de "umbrales bajos" o "de tipo T" y se expresan en neuronas nociceptivas Al usar un enfoque de represión génica por inyección intratecal de ADN anticodificante en rata, como se describe en Bourinet, E., et al., "Silencing of the CaV3.2 T-type calcium channel gene in sensor y neurons demonstrates its major role in nociception". Embo J., 2005. 24 (2) : pág. 315-24 (Ref 1) , los inventores han demostrado que la disminución de los canales de calcio Cav3.2 en neuronas nociceptivas de animales sanos o en estado de neuropatía conlleva una analgesia espectacular. En consecuencia, los canales de calcio de tipo T representan una diana potencial para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos del tratamiento del dolor.

Por otro lado, se ha demostrado que los canales de calcio Cav3.2 están implicados en la proliferación celular (Taylor, J.T., Zeng, X.B., Pottle, J.E., Lee, K., Wang, A.R., Yi, S.G., Scruggs, J.A., Sikka, S.S. y Li, M. (2008) "Calcium signaling and T-type calcium channels in cancer cell cycling". World J. Gastroenterol., 14, 4984-4991 (Ref 8) ) y en la regulación de la tensión sanguínea (Chen, C.C., Lamping, K.G., Nuno, D.W., Barresi, R., Prouty, S.J., Lavoie, J.L., Cribbs, L.L., England, S.K., Sigmund, C.D., Weiss, R.M., Williamson, R.A., Hill, J.A. y Campbell, K.P. (2003) "Abnormal coronar y function in mice deficient in alpha1H T-type Ca2+ channels". Science, 302, 1416-1418. (Ref 9) ) . Los canales de calcio de tipo T representan una diana potencial para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos del tratamiento del de hipertensión y cánceres, por ejemplo cánceres ligados a una proliferación anárquica de las células cancerosas.

Puede tratarse de cánceres de diversos órganos, por ejemplo:

 cáncer de próstata (véase GackiÃre F, Bidaux G, Delcourt P, Van Coppenolle F, Katsogiannou M, Dewailly E, Bavencoffe A, Van Chuoï-Mariot MT, Mauroy B, Prevarskaya N, Mariot P. (2008) "CaV3.2 T-type calcium channels are involved in calcium-dependent secretion of neuroendocrine prostate cancer cells". J. Biol. Chem., 283 (15) : 10162-73 (Ref 16) ,

 glioma (véase Panner A, Cribbs LL, Zainelli GM, Origitano TC, Singh S, Wurster RD. (2005) "Variation of Ttype calcium channel protein expression affects cell division of cultured tumor cells". Cell Calcium, 37 (2) : 105-19 (Ref 11) ) ,

 carcinoma de esófago (véase Lu F, Chen H, Zhou C, Liu S, Guo M, Chen P, Zhuang H, Xie D, Wu S. (2008) "T-type Ca2+ channel expression in human esophageal carcinomas: a functional role in proliferation" Cell Calcium. 43 (1) : 49-58 (Ref 12) )

 cáncer de mama (véase Taylor JT, Huang L, Pottle JE, Liu K, Yang Y, Zeng X, Keyser BM, Agrawal KC, Hansen JB, Li M (2008) "Selective blockade of T-type Ca2+ channels suppresses human breast cancer cell proliferation". Cancer Lett., 18; 267 (1) : 116-24 (Ref 13) .

En particular, es el objeto de la presente patente un enfoque farmacológico que usa antagonistas selectivos del canal Cav3.2 de tipo T.

La invención responde precisamente a la necesidad de encontrar nuevas moléculas analgésicas o antálgicas que proporcionen una nueva molécula capaz de inhibir especialmente una señal de dolor, más particularmente una molécula capaz de inhibir los receptores responsables de esta señal. Esta molécula es un péptido de secuencia: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) .

Se entiende por "derivado" que estos "fragmentos" o "derivados" son aquellos que conservan las propiedades del péptido de la presente invención. Puede considerarse igualmente que los derivados o fragmentos son análogos del péptido de la presente invención.

Por ejemplo, un derivado puede ser el péptido de secuencia ID NO1 con modificaciones en al menos uno de los aminoácidos. Las modificaciones son, por... [Seguir leyendo]

1. Péptido de secuencia aminoacídica YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) .

2. Ã?cidos nucleicos que codifican el péptido definido en la reivindicación 1.

3. Ã?cido nucleico según la reivindicación 2, en el que la secuencia de ácido nucleico es

en las que A es adenosina, C es citidina, G es guanosina, T es timidina y H es A o C o T, M es A o C, N es A o C o G o T, R es A o G, S es C o G, W es A o T e Y es C o T:

4. Sistema de expresión que comprende un plásmido y/o un vector de expresión que comprende un ácido 10 nucleico según la reivindicación 2.

5. Péptido antagonista de un canal de calcio de tipo T de secuencia aminoacídica: YCQKFLWTCDSERPCCEGLVCRLWCKIN (SEQ ID NO 1) .

6. Péptido antagonista de un canal de calcio de tipo T según la reivindicación 5, en el que dicho canal es un canal elegido del grupo que comprende el canal Cav3.2 y el canal Cav3.1.

7. Péptido según la reivindicación 1, para su uso como medicamento.

8. Péptido según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento del dolor.

9. Péptido según la reivindicación 1, para su uso como medicamento analgésico.

10. Procedimiento de síntesis del péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una etapa de síntesis química sobre soporte sólido o una etapa de síntesis por recombinación genética.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Secuencia de pT7-7:

Figura 6 (1/2)

Secuencia de pGex-4-T1:

Figura 6 (2/2)

Figura 7 (1/3)

Secuencia de pET32

Figura 7 (2/3)

Figura 7 (3/3)

Figura 8 Inhibición de Cav3.2 recombinante Péptido sintético frente al natural