Glucooligosacáridos que comprenden enlaces glicosídicos (alfa 1->4) y (alfa 1->6), su uso, y los métodos para producirlos.

Un método para producir una mezcla de glucooligosacáridos que tiene dos o más enlaces (α

1→6) glucosídicosconsecutivos y dos o más enlaces (α1→4) glucosídicos consecutivos, que comprende poner en contacto un sustrato de poli y/u oligosacáridos que comprende en su extremo no reductor al menos dos unidades de D-glucosa unidas enα-1→4 con una enzima α-glucanotransferasa capaz de escindir los enlaces (α1→4) glucosídicos y realizar nuevosenlaces (α1→4) y (α1→6) glucosídicos, y donde dicha α-glucanotransferasa es una enzima de tipo GTFB, o uno desus homólogos funcionales que tiene la actividad enzimática especificada.

Glucooligosacáridos que comprenden enlaces glicosídicos (alfa 1->4) y (alfa 1->6) , su uso, y los métodos para producirlos La invención se refiere al campo de los poli y oligosacáridos y sus efectos nutritivos. En particular, se refiere a la aplicación de α-glucanotransferasas en métodos para preparar fibra alimentaria, incluyendo oligosacáridos prebióticos, y a novedosos oligosacáridos que se pueden obtener a partir del anterior.

El término ‘fibra alimentaria’ se usó en primer lugar en 1953 por Hipsley para describir los componentes de la pared celular vegetal del alimento. Hoy en día existen muchas definiciones de fibra en uso, pero no existe todavía una definición universalmente aceptada. Generalmente, las fibras se derivan de fuentes de hidratos de carbono que tienen un componente no digerible. Las fibras se dividen normalmente en dos categorías; las fibras insolubles tales como el salvado de trigo, almidón resistente, hemicelulosa, lignina, etc, y las fibras solubles que se pueden clasificar

adicionalmente en dos subdivisiones: fibras solubles de longitud de cadena corta, incluyendo polidextrosa, inulina y oligosacáridos, y fibras solubles de longitud de cadena larga que incluyen pectinas, gomas (guar, goma garrofín, carragenato, xantana) y β-glucano (de avena o cebada, por ejemplo)

Las fibras alimentarias son prebióticos, ya que no se pueden digerir por enzimas humanas pero si pueden fermentarse por la flora del intestino grueso. De esta manera, aumentan la biomasa y la frecuencia de defecación, teniendo de esta manera un efecto positivo sobre el estreñimiento y sobre la salud de la mucosa del intestino grueso. Los hidratos de carbono prebióticos se producen naturalmente y se pueden encontrar en numerosos alimentos, incluyendo, espárragos, achicoria, tomates y trigo, así como siendo un componente natural de la leche humana.

El término prebiótico fue definido por Gibson y Roberfroid en 1995. Sin embargo, la definición inicial demostró ser difícil de verificar y desde entonces los autores han desarrollado adicionalmente el concepto proponiendo una nueva definición: “un prebiótico es un ingrediente fermentado selectivamente que permite cambios específicos en la composición y/o actividad en la microflora gastrointestinal que confieren beneficio al bienestar y la salud del hospedador” (Nutr Res Rev 2004; 17: 259-275) . Para que un ingrediente se pueda clasificar como prebiótico, se requiere por tanto que el ingrediente (i) resista la digestión (acidez gástrica, hidrólisis por las enzimas de los mamíferos y absorción gastrointestinal; (ii) sea fermentado por la microbiota intestinal, y (iii) estimule selectivamente el crecimiento y/o la actividad de las bacterias intestinales asociadas con la salud y el bienestar. El último criterio es la principal característica distintiva entre una fibra alimentaria y un prebiótico. Los prebióticos se reconocen generalmente por su capacidad para alterar la microbiota colónica promoviendo una composición y/o actividad más saludable aumentando la prevalencia de microorganismos sacarolíticos (que fermentan los hidratos de carbono) a la vez que reducen los microorganismos de la putrefacción (que fermentan las proteínas) .

Los hidratos de carbono no digeribles establecidos que cumplen los criterios prebióticos incluyen fructooligosacáridos (FOS) , galactooligosacáridos (GOS) , lactulosa, inulina y polidextrosa.

La polidextrosa es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa reticuladas aleatoriamente con todos los tipos de uniones glicosídicas. La polidextrosa Litesse es resistente a la digestión debido a su disposición única de enlaces glicosídicos. Molecularmente, predominan los enlaces (α1→6) , pero aproximadamente un 13% del polímero 45 tiene enlaces (α1→4) , que se pueden hidrolizar por enzimas en el intestino delgado humano. Se fermenta en la totalidad del colon y es particularmente eficaz en la mediación de un efecto probiótico en el colon distal. Los estudios de intervención en seres humanos han demostrado que la polidextrosa Litesse potencia las bifidobacterias y los Lactobacillus en una manera dependiente de la dosis.

El almidón es un polisacárido que se encuentra comúnmente en plantas verdes – aquellas que contienen clorofila – como medio de almacenamiento de energía. El almidón forma parte integral del mercado de millones de ingredientes alimenticios y se caracteriza por su naturaleza compleja y consolidada. El almidón es un ejemplo ideal de un producto básico esencial con una amplia gama de aplicaciones industriales, que incluye la fabricación de papel y cartón, la fermentación, los biocombustibles, los plásticos y detergentes biodegradables, los biopesticidas,

tensioactivos, poliuretanos, resinas, aglutinantes y disolventes. Sin embargo, es la industria alimenticia la que proporciona el mercado más grande para el almidón y sus derivados.

El almidón se degrada de forma completa bien en el intestino delgado a glucosa y se captura en la sangre o bien aquellas partes que escapan a la digestión finalizan en el intestino grueso, donde sirven como sustrato general para la flora microbiana colónica. El almidón y sus derivados por sí mismos no estimulan microorganismos colónicos beneficiosos específicos. Por tanto, el almidón por sí mismo no es un compuesto prebiótico. La solución parcial al problema es degradar el almidón al disacárido maltosa y a continuación usar una enzima transglucosidasa para convertir la maltosa en isomaltooligosacáridos (α1→6) unidos (IMO) con un grado de polimerización de 2 a 4. Estos productos IMO son, sin embargo, demasiado cortos y la mayor parte de las veces se degradan en el intestino 65 delgado, no alcanzando de esta manera el colon. La parte del producto IMO que alcanza el colon se degrada rápidamente en la parte proximal del colon por la microflora intestinal y no alcanza la parte distal donde residen las bacterias más malignas que degradan las proteínas. Para eliminar la competencia de estas bacterias malignas estimulando las especies beneficiosas, en particular las bifidobacterias, se requieren isomaltooligosacáridos más largos.

Anteriormente, se han desarrollado diversos métodos para la modificación química de los maltooligosacáridos (MOS) y el almidón (amilosa, amilopectina) . De forma más reciente, se han usado también diversas enzimas transglicosilasas (ciclodextrina glucanotransferasas, amilomaltasas, enzima ramificadora del almidón) para la modificación del almidón (amilosa, amilopectina) .

La presente invención proporciona medios y métodos adicionales para la modificación (enzimática) del almidón, derivados del almidón y/o MOS de diferente longitud de cadena a fin de cambiar sus propiedades funcionales y potenciar su valor nutritivo.

Se ha encontrado de forma sorprendente que estos objetivos se pueden cumplir mediante el uso de una α

glucanotransferasa del tipo GTFB de las glucansacarasas, miembro de la familia GH70 de las glicósido hidrolasas [http://www.cazy.org]. Aunque las enzimas glucansacarasas catalizan la conversión de la sacarosa en poli y oligosacáridos de α-glucano, se ha notificado anteriormente que GTFB no reacciona en forma alguna con la sacarosa (Kralj 2004) . Se describe en el presente documento que GTFB presenta una elevada actividad hacia los glucooligosacáridos que comprenden restos glucosa (α1→4) unidos, tales como maltooligosacáridos (MOS) . GTFB cataliza una reacción de tipo desproporcionante, acortando una molécula de sustrato y alargando una segunda molécula de sustrato. Ambos productos pueden ser de nuevo sustratos en la siguiente reacción. La actividad de GTFB puede dar de esta manera como resultado una serie de glucooligosacáridos lineales de hasta al menos DP35. El análisis estructural de los productos ha revelado que GTFB escinde los enlaces glucosídicos (α1→4) y establece nuevos enlaces (α1→4) y (α1→6) . Es el primer ejemplo de una enzima con esta especificidad de reacción y

producto. De acuerdo con esto, esta enzima se designa como (1→4) -α-D-glucano: (1→4) (1→6) -α-D-glucano α-Dglucanotransferasa o, de forma alternativa, como α-glucanotransferasa. Las enzimas glucansacarasas utilizan también MOS, pero solo como sustratos aceptores en presencia de sacarosa como sustrato donante. Esto da como resultado la síntesis de una gama de oligosacáridos, por ejemplo, una malosa extendida con una serie de unidades de glucosa unidas mediante enlaces (α1→6) en el caso de la destransacarasa. En el caso de las glucansacarasas, sin embargo los enlaces (α1→4) de los sustratos... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una mezcla de glucooligosacáridos que tiene dos o más enlaces (α1→6) glucosídicos consecutivos y dos o más enlaces (α1→4) glucosídicos consecutivos, que comprende poner en contacto un sustrato de poli y/u oligosacáridos que comprende en su extremo no reductor al menos dos unidades de D-glucosa unidas en α-1→4 con una enzima α-glucanotransferasa capaz de escindir los enlaces (α1→4) glucosídicos y realizar nuevos enlaces (α1→4) y (α1→6) glucosídicos, y donde dicha α-glucanotransferasa es una enzima de tipo GTFB, o uno de sus homólogos funcionales que tiene la actividad enzimática especificada.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha α-glucanotransferasa se selecciona entre las enzimas que se muestran en la Tabla 2, o uno de sus homólogos que muestran al menos un 55% de identidad de la secuencia en los aminoácidos con una enzima que se muestra en la Tabla 2.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicha α-glucanotransferasa se selecciona entre el grupo que

consiste en GTFB procedente de Lactobacillus reuteri 121, GTF106B procedente de Lactobacillus reuteri TMW 1.106, GTML4 procedente de Lactobacillus reuteri ML1, GTFDSM procedente de Lactobacillus reuteri DSM 20016A y GTF procedente de Lactobacillus fermentum ATCC 14931, o uno de sus homólogos que muestra al menos un 55% de identidad de la secuencia en los aminoácidos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha α-glucanotransferasa muestra al menos un 60% de identidad de la secuencia en los aminoácidos con GTFB procedente de Lactobacillus reuteri 121.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicha α-glucanotransferasa es una enzima genéticamente modificada que pertenece a tipo GTFA de las enzimas glucansacarasas que comprenden al

menos una de las mutaciones de la Tabla 1, siendo capaz dicha enzima mutante de escindir enlaces (α1→4) glucosídicos y realizar nuevos enlaces (α1→4) y (α1→6) glucosídicos.

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde dicho sustrato tiene un grado de polimerización de al menos 4.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho sustrato se selecciona entre el grupo que consiste de almidón, almidón cerúleo, almidón con un elevado contenido de amilosa, derivados de almidón, maltooligosacáridos, amilosa, amilopectina, maltodextrinas, (α1→4) glucanos, reuteran, o sus combinaciones.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicho almidón, almidón cerúleo, almidón con un elevado contenido de amilosa o derivado de almidón, se deriva de patata, maíz, tapioca, guisante, judía mungo, arroz o trigo.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, donde dicho derivado de almidón se produce tratando almidón, almidón cerúleo, o almidón con un elevado contenido de amilosa con una enzima amilomaltasa/4-alfaglucanotransferasa o enzima ramificadora de glucógeno.

10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de

aislar a partir de la mezcla al menos uno glucooligosacárido que tiene dos o más enlaces (α1→6) glucosídicos 45 consecutivos y dos o más enlaces (α1→4) glucosídicos consecutivos.

11. Un glucooligosacárido o resto de glucooligosacárido lineal de fórmula general A-B, o una mezcla que comprende glucooligosacáridos o restos de glucooligosacáridos lineales diferentes de fórmula general A-B, donde A comprende dos o más enlaces (α1→6) glucosídicos consecutivos, donde el enlace entre A y B es un enlace (α1→6) glucosídico, y donde B comprende al menos dos restos de glucosa (α1→4) unidos consecutivos.

12. Glucooligosacárido o mezcla de glucooligosacáridos de acuerdo con la reivindicación 11, donde la relación entre los enlaces (α1→6) y (α1→4) glucosídicos varía entre 20:80 y 90:10.

13. Glucooligosacárido o mezcla de glucooligosacáridos de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, donde A comprende un isomaltooligosacárido con un grado de polimerización de al menos 4 restos de glucosa.

14. Glucooligosacárido o mezcla de glucooligosacáridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1113, donde el grado de polimerización promedio es al menos de 7.

15. Composición nutritiva o cosmética que comprende un glucooligosacárido o una mezcla de glucooligosacáridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14.

16. Composición nutritiva de acuerdo con la reivindicación 15, seleccionada entre el grupo que consiste en un

producto lácteo, fórmula de bebé o infantil, producto de pastelería, barrita de cereales, barrita dulce, producto de pasta, producto de fideos, bebida líquida, bebida deportiva, bebida y helado.

17. Uso de un glucooligosacárido o mezcla de glucooligosacáridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14 como un aditivo nutritivo o cosmético.

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, como fibra prebiótica. 5

19. Una enzima modificada genéticamente que pertenece al tipo GTFA de las enzimas glucansacarasas que comprende al menos dos de las mutaciones de la Tabla 1, siendo capaz dicha enzima mutante de escindir enlaces (α1→4) glucosídicos y realizar nuevos enlaces (α1→4) y (α1→6) glucosídicos y tener una preferencia por el sustrato por sustratos de poli y/u oligosacáridos que comprenden unidades de D-glucosa unidas (α1→4) .

20. Uso de una enzima capaz de escindir enlaces (α1→4) glucosídicos y realizar nuevos enlaces α1→4) y (α1→6) glucosídicos, y/o transferir una unidad de maltosa, maltotriosa o maltotetraosilo realizando un nuevo enlace (α1→6) glucosídico, donde dicha enzima es una α-glucanotransferasa del tipo GTFB, o uno de sus homólogos funcionales que tiene la actividad enzimática especificada, en un método para producir derivados de almidón de fórmula general

A-B, donde A comprende dos o más enlaces (α1→6) glucosídicos consecutivos, donde el enlace entre A y B es un enlace (α1→-6) glucosídico, y donde B comprende al menos dos restos de glucosa (α1→-4) unidos consecutivos.