Fragmentos de trombospondina y usos de los mismos en ensayos clínicos para cáncer y generación de anticuerpos y otros agentes de unión.

Un método para detectar la presencia de o controlar el curso clínico de una enfermedad neoplásica en un individuo,

en donde el método comprende las etapas de:

(1) medir en una muestra el nivel en plasma del individuo de un fragmento o fragmentos de trombospondina;

(2) utilizar el resultado de la etapa (1) en un diagnóstico en cuanto a si el individuo tiene una enfermedad neoplásica de modo que cuanto mayor sea el nivel plasmático de dicho fragmento o fragmentos de trombospondina, mayor será la probabilidad de que el diagnóstico sea que está presente una enfermedad neoplásica en dicho individuo; en donde o bien:

(i) dicho fragmento o fragmentos están dentro de un intervalo molecular seleccionado entre el grupo que consiste en 80 a 110 kDa, 40 a 60 kDa y 20 a 35 kDa; o

(ii) dicho método comprende el uso de un agente de unión que se une a un epítopo dentro de un fragmento plasmático en el intervalo de peso molecular seleccionado entre el grupo que consiste en 80 a 110 kDa, 40 a 60 kDa y 20 a 35 kDa; y

en el que el tamaño en kDa es el determinado por electroforesis en gel después de reducción de los enlaces disulfuro.

Fragmentos de trombospondina y usos de los mismos en ensayos clínicos para cáncer y generación de anticuerpos y otros agentes de unión Campo de la invención La presente invención se refiere a ensayos para los niveles sanguíneos de uno o más fragmentos de trombospondina como ensayo de diagnóstico para cánceres y otras enfermedades, el uso de dichos fragmentos y/o derivados de los mismos para generar anticuerpos específicos y otros agentes de unión y/o al uso como calibradores, competidores, y/o indicadores en un ensayo, y a los fragmentos en sí mismos.

Antecedentes de la invención La trombospondina (TSP) , también conocida como TSP-1, es una glucoproteína multimérica compuesta por monómeros idénticos. Los monómeros migran a un peso molecular aparente de aproximadamente 185 kDa en geles electroforéticos de SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras. El multímero predominante es un trímero, que migra a un peso molecular aparente de aproximadamente 450 kDa en geles no reductores. Los pesos moleculares por equilibrio de sedimentación son similares, en 135 kDa para monómeros y 420 kDa para trímeros. El peso molecular predicho a partir justo de la secuencia de restos aminoacilo en el monómero es 127, 524 Da, que no incluye contribuciones de glucosilación y β-hidroxilación. La glucoproteína trombospondina se produce por plaquetas y se libera tras la activación de las plaquetas desde α-gránulos de plaquetas, junto con muchas otras proteínas, tales como factor del crecimiento derivado de plaquetas, β-tromboglobulina, fibronectina, fibrinógeno, y factor-4 de plaquetas (véase el Capítulo 1, "An introduction to the thrombospondins" en The Thrombospondin Gene Family por JC Adams, RP Tucker, y J Lawler, Springer-Verlag: Nueva York, 1995, pág. 1-9, pero especialmente la pág. 2 ; y el Capítulo 3, "The secondar y and tertiar y structure of the thrombospondins, " ibídem pág. 43-56, especialmente la Tabla 3.1) . Se ha identificado un fragmento proteolítico N-terminal de trombospondina (véase Damas Conchi et al, Thrombosis and Haemostasis, Stuttgart, DE, vol. 86, Nº 3, pág. 887-893 (2001) ) , y tiene un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un fragmento de trombospondina encontrado en extractos celulares (véase Morandi et al, FEBS letters, vol. 346, nº 2-3, pág. 156-160, (1994) ) . Se sabe que la trombospondina está implicada en procesos biológicos tales como adhesión celular, proliferación y quimiotaxis. Los péptidos de trombospondina han demostrado inhibir la angiogénesis de la retina, y la proliferación de células endoteliales mesangiales y glomerulares (véanse Shafiee et al, Investigative ophthalmology & Visual Science, Assoc for Research in Vision and Ophthalmology, US, vol. 41, Nº 8, pág. 2378-2388 (2000) y Hugo Christian et al, Kidney International, vol. 55, Nº 6, pág. 2236-2249 (1999) ) , y se ha informado que diferentes fragmentos de trombospondina tienen diferentes efectos sobre la angiogenesis (véase Taraboletti et al, The FASEB Journal, vol. 14, Nº 12, pág. 1674-1676 (2000) ) . También se ha informado de que la trombospondina puede estar implicada en la progresión de tumores malignos y la trombospondina y fragmentos de la misma se han propuesto como agentes medicinales, por ejemplo para su uso en tratamiento de tumores (véanse el documento US 5.840.692 A, (Howard et al) y el documento US 5. 770. 563 A (Roberts et al) ) . Se ha informado de los fragmentos N-terminales de trombospondina como marcadores de enfermedad artrítica (véase el documento WO 98/07035 A (Ciba Geigy AG) ) . Además, se ha informado de que la trombospondina se expresa elevadamente en muchos tejidos malignos humanos y en el estroma y/o endotelio adyacente y se ha informado que está presente en niveles mayores que los normales en el plasma de pacientes con cáncer. (Por ejemplo, Qian y Tuszynski, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 212:199-207, 1996; de Fraipont F et al. Trends Mol. Med., 7: 401-407, 2001) . Se ha informado de niveles plasmáticos elevados de trombospondina ligados a metástasis y estratificación de la enfermedad en cáncer (véase Yamashita et al, Cancer vol. 82, Nº 4, pág. 632-638 (1998) , Kuroi et al, Int J Biol Markers, Vol. 16, Nº 1, pág. 5-26 (2001) , Tuszynski et al, Thrombosis and Haemostatis, Vol. 67, Nº 6, pág. 607-611 (1992) ) .

A pesar de lo anterior, como para cualquier ensayo de diagnóstico potencial, sería deseable aumentar la especificidad y la sensibilidad de dichos ensayos. Para ese fin, el presente inventor ha descubierto que la trombospondina está presente en la sangre y el plasma sanguíneo en cantidades relativamente pequeñas en comparación con los fragmentos de trombospondina, y este hallazgo es cierto en la sangre y plasma sanguíneo de pacientes con cáncer también. Este descubrimiento proporciona una base para las presentes invenciones referidas a nuevos ensayos de diagnóstico que son más específicos, más sensibles, más fácilmente calibrados, y en algunos casos distinguen estos fragmentos de trombospondina entre sí y de la propia trombospondina.

Breve sumario de la invención Son importantes aspectos de la invención métodos de diagnóstico para detectar o controlar el estado de un cáncer y que saben en la detección y cuantificación de fragmentos de trombospondina en fluidos corporales, especialmente plasma.

También se describen, y estrechamente relacionados a los métodos de diagnóstico, fragmentos de trombospondina que se detectan en el plasma, fragmentos de trombospondina que pueden usarse para inducir un anticuerpo de interés para su uso en un método de diagnóstico o que pueden usarse en un ensayo de diagnóstico de tipo

competitivo o no competitivo.

La invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1.

Fragmentos de trombospondina En este documento se describe un fragmento de trombospondina purificado que se ha extraído de un fluido corporal, especialmente plasma, siendo dicho fragmento uno dentro de un intervalo de peso molecular seleccionado entre el grupo que consiste en 80 a 110 kDa, 40 a 60 kDa, y 20 a 35 kDa, donde el tamaño en kDa es el determinado por electroforesis en gel después de reducción de los enlaces disulfuro. Los usos de dichos fragmentos incluyen a) la inducción de un anticuerpo de interés, b) la inducción de un anticuerpo para un método de diagnóstico, c) el uso en un ensayo de diagnóstico de tipo competitivo, d) como molécula de referencia en un ensayo para un fragmento o fragmentos de trombospondina o trombospondinas de sujetos humanos, y e) la inmunización de un animal.

También se describe en este documento un polipéptido o polipéptido modificado, preparado por técnicas recombinantes y/o químicas, que tiene la estructura primaria idéntica que uno de dichos fragmentos purificados de trombospondina o una parte de los mismos. Dichas técnicas químicas incluyen, aunque sin limitación, glucosilación, β-hidroxilación, alquilación y reducción.

En realizaciones particulares, el peso molecular del fragmento es uno dentro de un intervalo de peso molecular seleccionado entre el grupo que consiste en 80 a 95 kDa, 47 a 53 kDa, y 27 a 33 kDa. Ejemplos específicos de pesos moleculares de fragmentos son 85, 90, 50, y 30 kDa. Preferiblemente, el fragmento es uno encontrado en plasma humano.

También se describe un fragmento purificado y/o sintético de trombospondina o parte del mismo, siendo dicho fragmento uno que empieza entre el aminoácido I-165 (justo después del péptido N12/I) y V-263 (el inicio del dominio de homología de procolágeno) , inclusive (es decir, inclusive I-165 y V-263) , y acaba entre el aminoácido K412 (el final de la región de unión a colágeno tipo-V presentada) e I-530 (el final del dominio de repeticiones tipo 1) , inclusive. Se prefieren los fragmentos que empiezan entre N-230 y G-253, inclusive (en o cerca del inicio del dominio de enlaces disulfuro intercatenarios, I-241, que es primer resto cadena abajo [que significa hacia el extremo Cterminal de la proteína completa] de un sitio de escisión predicho para quimotripsina y/o una proteasa tipo quimotripsina) , y finaliza entre V-400 y S-428, inclusive (en o cerca de un sitio de escisión por quimotripsina predicho, F-414, que cae dos restos después del final de la región de unión a colágeno tipo-V) , siendo dicha parte de al menos 3 aminoácidos de longitud (preferiblemente al menos 4 retos aminoacilo de longitud, más preferiblemente de al menos 6 restos aminoacilo) .

Se describe en este documento un fragmento purificado y/o sintético de trombospondina o parte del mismo, siendo dicho fragmento uno empieza entre el aminoácido I-165 (justo después del péptido N12/1) y V-263 (el inicio del dominio de homología de procolágeno) , inclusive, y finaliza... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de o controlar el curso clínico de una enfermedad neoplásica en un individuo, en donde el método comprende las etapas de:

(1) medir en una muestra el nivel en plasma del individuo de un fragmento o fragmentos de trombospondina;

(2) utilizar el resultado de la etapa (1) en un diagnóstico en cuanto a si el individuo tiene una enfermedad neoplásica de modo que cuanto mayor sea el nivel plasmático de dicho fragmento o fragmentos de trombospondina, mayor será la probabilidad de que el diagnóstico sea que está presente una enfermedad neoplásica en dicho individuo; en donde o bien:

(i) dicho fragmento o fragmentos están dentro de un intervalo molecular seleccionado entre el grupo que consiste en 80a 110 kDa, 40a 60kDa y 20a 35kDa;o

(ii) dicho método comprende el uso de un agente de unión que se une a un epítopo dentro de un fragmento plasmático en el intervalo de peso molecular seleccionado entre el grupo que consiste en 80 a 110 kDa, 40 a 60 kDay 20 a35kDa; y

en el que el tamaño en kDa es el determinado por electroforesis en gel después de reducción de los enlaces disulfuro.

2. El método de la reivindicación 1 donde el individuo mencionado en la misma es un primer individuo y el nivel plasmático mencionado en la misma es el nivel plasmático de fragmento del primer individuo y en donde el método comprende adicionalmente las etapas de:

(3) medir, en un segundo individuo, el nivel plasmático del mismo fragmento o fragmentos de trombospondina medidos para el primer individuo, considerando que dicho segundo individuo no tiene enfermedad neoplásica, el nivel plasmático de dicho fragmento o fragmentos en el segundo individuo es el nivel plasmático de fragmento del segundo individuo;

(4) utilizar el resultado de la etapa (3) en el diagnóstico de si el primer individuo tiene una enfermedad neoplásica de modo que cuanto mayor sea el grado al cual excede el nivel de fragmento plasmático del primer individuo al nivel plasmático del segundo individuo, mayor será la probabilidad de que el diagnóstico sea que está presente una enfermedad neoplásica en el primer individuo.

3. El método de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente las etapas de ensayar el nivel plasmático de un individuo de un fragmento o fragmentos de trombospondina más de una vez, y utilizar un cambio en dicho nivel plasmático de un valor más antiguo a uno más reciente para indicar la aparición o la progresión o la mejora de una enfermedad neoplásica en donde dichas aparición o progresión están indicadas por un aumento en el nivel plasmático y dicha mejora está indicada por una disminución en dicho nivel plasmático.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la medición del nivel plasmático de un fragmento o fragmentos de trombospondina comprende el uso de un agente de unión, siendo capaz dicho agente de unión de unirse a dicho fragmento o fragmentos.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el fragmento o fragmentos de trombospondina se separan de la trombospondina antes de que dicho fragmento o fragmentos se unan al agente de unión.

6. El método de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que el agente de unión es un anticuerpo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el peso molecular del fragmento o de cada uno de los fragmentos está dentro de un intervalo de peso molecular seleccionado entre el grupo que consiste en fragmento de 85 a 90 kDa, 47 a 53 kDa y 27 a 33 kDa, en el que el tamaño en kDa es el determinado por electroforesis en gel después de reducción de los enlaces disulfuro.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el peso molecular del fragmento o fragmentos está dentro de un intervalo de 80 a 110 kDa en el que el tamaño en kDa es el determinado por electroforesis en gel después de reducción de los enlaces disulfuro.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas adicionales de:

3) utilizar un primer agente de unión para obtener una cuantificación de un total, trombospondina más el fragmento o fragmentos de trombospondina; 4) utilizar un segundo agente de unión para obtener una cuantificación de trombospondina solamente; 5) utilizar la diferencia entre las cuantificaciones obtenidas en las etapas (3) y (4) como una cuantificación de la cantidad de fragmento o fragmentos de trombospondina; y 6) utilizar el resultado de la etapa (5) en un diagnóstico en cuanto a si el individuo tiene una enfermedad neoplásica de modo que cuanto mayor sea el nivel plasmático de dicho fragmento o fragmentos de 26

trombospondina, mayor será la probabilidad de que el diagnóstico sea que está presente una enfermedad neoplásica en dicho individuo; en donde el primer agente de unión se une a un epítopo compartido por trombospondina y el fragmento o fragmentos de trombospondina como se define en la reivindicación 1, y en donde el segundo agente de unión se une a un epítopo presente en trombospondina pero no presente en el fragmento o fragmentos.

10. El método de la reivindicación 9, en el que uno o los dos de dicho primer y segundo agentes de unión son un anticuerpo.