Etiquetas de aldehído, usos de estas en la modificación sitio específica de proteínas.

Un método de modificación de un polipéptido objetivo, el polipéptido objetivo que comprende una etiqueta heteróloga de aldehído,

la etiqueta aldehído que consiste de hasta 12 residuos de aminoácidos y que comprende:

X1Z1X2Z2X3R

en donde

Z1 es cisteína o serina;

Z2 es un residuo de prolina o alanina;

X1 está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido con la condición de que cuando la etiqueta de aldehído está en un N-terminal del polipéptido, X1 está presente;

X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido;

el método que comprende poner en contacto el polipéptido objetivo con una enzima generadora de formilglicina (FGE) de manera que Z1 se convierte a un residuo de formiglicina (FGly) en el polipéptido y se produce un polipéptido convertido etiquetado con aldehído

Etiquetas de aldehído, usos de estas en la modificación sitio específica de proteínas

Antecedentes 5

El marcaje sitio específico de las proteínas es una herramienta importante para la disección de las redes celulares y bioquímicas. Se ha desarrollado una variedad de tecnologías para enfrentar esta necesidad. Una de tales tecnologías usadas para la localización de proteínas y su seguimiento es el marcaje con proteínas fluorescentes, tales como la proteína verde fluorescente (GFP) . Sin embargo, el tamaño de estas proteínas fluorescentes puede interferir con el 10 tráfico, la localización y las interacciones proteína-proteína del objetivo (Lisenbee y otros Traffic 2003, 4, (7) , 491-501) .

Como resultado, muchos grupos han centrado su atención en el uso de fusiones más pequeñas para dirigir a reactivos de marcaje secundario específicos. FlAsH, desarrollado por Roger Tsien y colegas, utiliza la interacción entre motivos de tetracisteína dispuestos específicamente y fluoróforos de biarsenilo (Chen y otros Science 1998, 281, (5374) , 269-15 272) . A pesar de la afinidad picomolar entre la secuencia mínima de 8 aminoácidos y las sondas biarsenicales (Adams y otros J. Amer.Chem. Soc. 2002, 124, (21) , 6063-6076) , el fondo debido a los motivos de cisteína nativos sigue siendo un problema (Stroffekova y otros Pflugers Archiv-Eur.J. Physiol. 2001, 442, (6) , 859-866) .

Para aumentar la especificidad, se han explorado los motivos dirigidos a péptido que dependen del marcaje secundario 20 mediante enzimas. Tal estrategia depende de la fusión con O6-alquilguanina ADN transferasa (hAGT) , que puede ligar una amplia variedad de moléculas pequeñas a una cisteína interna. Si bien las fusiones con hAGT permiten la unión covalente muy específica, de una amplia variedad de sondas de molécula pequeña estas se basan en una fusión de 207 aminoácidos (George y otros J. Amer.Chem. Soc. 2004, 126, (29) , 8896-8897; Guignet y otros Nature Biotechnol 2004, 22, (4) , 440-444) . En un enfoque distinto, las fusiones de las proteínas con la proteína portadora de acilo de 25 aproximadamente 80 aminoácidos pueden marcarse específicamente con sondas derivadas de CoA con el uso de la enzima fosfopanteteína transferasa. Alternativamente, se ha usado la biotina ligasa para transferir biotina o un isóstero de biotina que contiene cetona a un péptido aceptor de 15 aminoácidos. El apéndice del isóstero de cetona permite la formación de hidrazonas y conjugados oxima.

30 Prescher y otros (2005) Nature Chemical Biology Vol. 1 (1) págs. 13-21 se refieren a cómo la enzima generadora de formilglicina (FGE) puede usarse para convertir un residuo de cisteína a formilglicina la que subsecuentemente puede marcarse químicamente con reactivos aminooxi o hidrazida. La modificación con FGE del residuo de cisteína debe producirse en una secuencia consenso objetivo conservada de 13 residuos.

35 Dierks y otros (2003) Cell vol 113, págs. 435 - 444 describe un ensayo in vitro de FGE. La FGE se purifica a partir de testículo bovino, la FGE humana se clona y se secuencia. La actividad de la FGE en células transfectadas se detecta mediante inmunofluorescencia indirecta y transferencia Western. Un péptido arilsulfatasa A (ASA) de 23 aminoácidos de origen natural se usó como sustrato para un ensayo de FGE. Otro péptido de 16 aminoácidos se unió a una matriz de cromatografía de afinidad y se usó en la purificación por afinidad de la FGE. 40

Dierks y otros (1999) EMBO J. col 18 págs. 2081 - 2091 describen los experimentos y un sistema de ensayo para establecer los determinantes basados en la secuencia responsables de la conversión de cisteína a FGly en las sulfatasas eucariotas. Se modificaron y probaron secuencias de arilsulfatasa (ASA) de origen natural y se encontró que tiene que estar presente el quot;motivo auxiliarquot; de los residuos de aminoácidos 74 - 80 de la ASA. 45

Hay una necesidad de nuevos enfoques para la modificación sitio específica de proteínas.

Literatura Adams y otros 2002 J. Amer. Chem. Soc. 2002, 124, (21) , 6063-6076; Banghart y otros 2004 Nat. Neurosci. 7 (12) :1381-6. Epub 21 de nov. 2004; Berteau y otros 2006 J Biol Chem. 281 (32) :22464-70 (Epub 9 de jun. 2006) ; Chen y otros 2005 Nature Methods 2005, 2, (2) , 99-104; Cosma y otros 2003 Cell 113, (4) , 445-56; Dierks y otros 1997 Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 94, (22) , 11963-8; Dierks y otros 2003 Cell 113, (4) , 435-44; Dierks y otros 2005 Cell 121, (4) , 541-52; George y otros 2004 J. Amer. Chem. Soc. 126, (29) , 8896-8897; Griffin y otros 1998 Science 281, (5374) , 269-55 272; Guignet y otros 2004 Nature Biotechnol. 22, (4) , 440-444; Landgrebe y otros 2003 Gene 316:47-56; Lemieux (1998) Trends Biotechnol 16, 506-13; Lisenbee y otros 2003 Traffic 4, (7) , 491-501; Mariappan y otros 2005 J. Biol. Chem. 280 (15) :15173-9 (Epub 11 de feb. 2005) ; Mougous y otros 2004 Nat. Struc. MoI. Biol. 11, 721- 729; Preusser y otros 2005 J. Biol. Chem. 280 (15) : 14900-10 (Epub 18 de ene. 2005) ; Roeser y otros 2006 Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 103 (1) :81-6 (Epub 20 de dic. 2005) ; Rush y otros (5 de ene. 2006) Org Lett. 8 (1) ;131-4; Sardiello y otros 2005 Human 60 Mol. Genet. 14, 3203-3217; Schirmer y otros 1998 Chemistr y & Biology 5, R181-R186; Schmidt y otros 1995 Cell 82, (2) , 271-8; Stroffekova y otros 2001 Archiv-Europ. J. Physiol. 442, (6) , 859-866; Szameit y otros 1999 J Biol Chem 274, (22) , 15375-81; Yin, J. y otros 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 102, 15815- 15820 (2005) ; US20050026234; US20030186229; y US 6, 900, 304.

Resumen

La invención presenta métodos para la modificación sitio específica de proteínas mediante la incorporación de una etiqueta de aldehído. La modificación enzimática en un motivo sulfatasa de la etiqueta de aldehído a través de la acción de una enzima generadora de formilglicina (FGE) genera un residuo de formilglicina (FGly) . La porción aldehído del 5 residuo de FGIy puede explotarse como un asa química para la unión sitio específica de una porción de interés a un polipéptido.

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para modificar un polipéptido, que comprende poner en contacto un polipéptido que comprende un motivo sulfatasa heterólogo convertido con una pareja reactiva que 10 comprende una porción de interés, en donde el motivo sulfatasa convertido comprende:

X1 (FGly) X2Z2X3R 15

en donde

FGly es un residuo de formilglicina;

Z2 es un residuo de prolina o alanina; 20

X1 está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la condición de que cuando el motivo sulfatasa heterólogo está en un N-terminal del polipéptido, X1 está presente; y

X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido;

en donde dicho contacto es bajo condiciones suficientes para la conjugación de la porción de interés de la pareja 25 reactiva a la FGly del polipéptido, que produce de esta manera un polipéptido modificado.

El residuo de FGly puede estar posicionado en una secuencia interna del polipéptido, y/o posicionado en un bucle terminal, un C-terminal, o un N-terminal del polipéptido. De particular interés son las situaciones en las que el residuo de FGly puede estar presente en una región accesible al disolvente del polipéptido cuando se pliega. Adicionalmente son 30 de interés las situaciones en las que el residuo de FGly puede estar presente en un sitio de modificación postraduccional del polipéptido, tal como un sitio de glicosilación. Estos sitios de modificación postraduccional pueden ser nativos para el polipéptido progenitor, o el polipéptido puede diseñarse para incluir uno o más sitios no nativos de modificación postraduccional, y el motivo sulfatasa heterólogo está posicionado en dicho uno o más sitios no nativos de modificación postraduccional. 35

De particular interés son los motivos sulfatasa donde X1, cuando está presente, es L, M, V, S o T. Los motivos sulfatasa adicionales de particular interés son aquellos donde X2 y X3 son cada uno independientemente un aminoácido alifático, un aminoácido polar, sin carga, o un aminoácido que contiene azufre (es decir, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado) , y en ciertas modalidades son cada uno independientemente S, T, A, V, G o C. 40

La presente invención proporciona además una modificación de un polipéptido que comprende poner en contacto un polipéptido que comprende un motivo sulfatasa heterólogo con una enzima generadora de formilglicina (FGE) , en donde el motivo sulfatasa heterólogo comprende:

45 X1Z1X2Z2X3R

en donde

Z1 es cisteína o serina; 50... [Seguir leyendo]

1. Un método de modificación de un polipéptido objetivo, el polipéptido objetivo que comprende una etiqueta heteróloga de aldehído, la etiqueta aldehído que consiste de hasta 12 residuos de aminoácidos y que comprende:

5 X1Z1X2Z2X3R

en donde

Z1 es cisteína o serina; 10

Z2 es un residuo de prolina o alanina;

X1 está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido con la condición de que cuando la etiqueta de aldehído está en un N-terminal del polipéptido, X1 está presente;

X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido;

el método que comprende poner en contacto el polipéptido objetivo con una enzima generadora de 15 formilglicina (FGE) de manera que Z1 se convierte a un residuo de formiglicina (FGly) en el polipéptido y se produce un polipéptido convertido etiquetado con aldehído.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene al menos una de las siguientes propiedades: 20

(a) la etiqueta de aldehído está posicionada en el N-terminal del polipéptido;

(b) la etiqueta de aldehído está posicionada en un sitio interno de una secuencia de aminoácidos nativa para el polipéptido;

(c) la etiqueta de aldehído está posicionada en un bucle terminal del polipéptido; o 25

(d) la etiqueta de aldehído está posicionada en un sitio de modificación postraduccional del polipéptido.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde la etiqueta de aldehído está posicionada en un C-terminal del polipéptido.

4. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde

(a) la etiqueta de aldehído está presente en un sitio interno en un bucle terminal del polipéptido; o (b) la etiqueta de aldehído está presente en un sitio interno o en el N-terminal y es accesible al disolvente cuando el polipéptido se pliega; o 35

(c) la etiqueta de aldehído está posicionada en un sitio de modificación postraduccional del polipéptido que es un sitio de glicosilación; preferentemente en donde el polipéptido objetivo se diseña para incluir uno o más sitios no nativos de modificación postraduccional, y en donde la etiqueta de aldehído está posicionada en dicho uno o más sitios no nativos de modificación postraduccional.

5. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde el polipéptido es una proteína de transmembrana y la etiqueta de aldehído está presente en un sitio interno dentro de un bucle extracelular o un bucle intracelular.

6. Un método como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en donde el polipéptido se expresa en 45 una célula que contiene la FGE.

7. Un método como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en donde el método comprende además poner en contacto el polipéptido convertido etiquetado con aldehído con una molécula reactiva que comprende una porción de interés; en donde dicho contacto es bajo las condiciones que proporcionan la 50 producción de un producto de reacción de un polipéptido modificado etiquetado con aldehído que tiene la porción de interés unida covalentemente al residuo de FGly del motivo sulfatasa heterólogo.

8. Un método de modificación de un polipéptido objetivo, el polipéptido objetivo que comprende una etiqueta heteróloga convertida de aldehído, la etiqueta de aldehído que consiste de hasta 12 residuos de aminoácidos y 55 que comprende:

X1 (FGly) X2Z2X3R

en donde 60

FGly es un residuo de formilglicina;

Z2 es un residuo de prolina o alanina;

X1 está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la condición de que cuando la etiqueta aldehído es al menos un N- terminal del polipéptido, X1 está presente; y

X2 y X3 son cada uno independientemente cualquier aminoácido;

el método que comprende poner en contacto el polipéptido objetivo con una molécula reactiva que comprende una porción de interés de manera que la porción de interés se conjuga a la FGly del 5 polipéptido, produciendo de esta manera un polipéptido modificado.

9. Un método como el reivindicado en la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la porción de interés es un polímero soluble en agua, un marcador detectable, un fármaco, un péptido, una toxina, una porción para la inmovilización del polipéptido en una membrana o sobre una superficie. 10

10. Un método como el reivindicado en la reivindicación 8, en donde el motivo sulfatasa comprende L (FGly) TPSR, M (FGly) TPSR, V (FGly) TPSR, L (FGly) SPSR, L (FGly) APSR L (FGly) VPSR, o L (FGly) GPSR.

11. Un método para la producción de un polipéptido modificado, que comprende el cultivo de una célula que 15 comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido objetivo, el polipéptido objetivo que comprende una etiqueta heteróloga de aldehído, y un polinucleótido que codifica una enzima generadora de formilglicina (FGE) , en donde la etiqueta heteróloga de aldehído consiste de hasta 12 residuos de aminoácidos y comprende:

20 X1Z1X2Z2X3R

en donde

Z1 es cisteína o serina; 25

Z2 es un residuo de prolina o alanina;

X1 está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido con la condición de que cuando la etiqueta aldehído está en un N-terminal del polipéptido, X1 está presente; y, X2 y X3 independientemente puede ser cualquier aminoácido;

y en donde dicho cultivo resulta en la expresión del polipéptido y la FGE y la conversión de un residuo de 30 cisteína o serina de la etiqueta heteróloga de aldehído por la FGE a un residuo de 2-formilglicina (FGly) para producir un polipéptido convertido etiquetado con aldehído.

12. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11, en donde la célula es una célula de un mamífero.

13. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11, en donde la célula es una célula procariota.

14. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde el método comprende además:

poner en contacto el polipéptido convertido etiquetado con aldehído con una molécula reactiva que comprende una porción de interés; en donde dicho contacto es bajo las condiciones para proporcionar la producción de un producto de reacción de un polipéptido modificado etiquetado con aldehído que tiene la porción de interés unida covalentemente a un residuo de FGly del polipéptido convertido etiquetado con aldehído. 45

15. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde el residuo de FGly está posicionado en una secuencia interna del polipéptido.

16. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde el residuo de FGly está 50 posicionado en un bucle terminal, un C-terminal, o un N-terminal del polipéptido; o en una región del polipéptido accesible al disolvente cuando se pliega.

17. Un método como el reivindicado en la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde el residuo de FGly está presente en un sitio de modificación postraduccional del polipéptido; preferentemente en donde el sitio de 55 modificación postraduccional es un sitio de glicosilación; o en donde el polipéptido objetivo está diseñado para incluir uno o más sitios no nativos de modificación postraduccional, y en donde la etiqueta de aldehído está posicionada en dichos uno o más sitios no nativos de modificación postraduccional.

18. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 11 a 17, en donde la etiqueta de 60 aldehído comprende LCTPSR, MCTPSR, VCTPSR, LCSPSR, LCAPSR LCVPSR, o LCGPSR.

19. Un método como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en donde X1, cuando está presente, X2, y X3 son cada uno independientemente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado.

20. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde X1, (cuando está 5 presente) es L, M, V, S o T y/o X2 y X3 son cada uno independientemente S, T, A, V, G, o C.

21. Un método como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en donde el polipéptido objetivo comprende dos o más etiquetas de aldehído.

22. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido es un anticuerpo.

23. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde la etiqueta de aldehído consiste de hasta 11 residuos de aminoácidos. 15

24. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde la etiqueta de aldehído consiste de hasta 10 residuos de aminoácidos.

25. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde la etiqueta de aldehído 20 consiste de hasta 9 residuos de aminoácidos.

26. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde la etiqueta de aldehído consiste de hasta 8 residuos de aminoácidos.