Especies de pestivirus.

Una secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN del virus PMC que se une al ácido nucleico de PMC en condiciones rigurosas de hibridación caracterizada por que dicha secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN del virus PMC consiste en:

a) la SEC ID Nº 11, en la que cuando la secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN es una secuencia de nucleótidos de ARN, los nucleótidos de timidina (t) están sustituidos con nucleótidos de uridina (u);

b) una secuencia de ARN o ADN que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia sobre al menos 100 nucleótidos con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 11; o

c) una secuencia de nucleótidos de ARN o ADN que comprende el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

Especies de pestivirus Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo pestivirus, y secuencias génicas derivadas del mismo. La invención se refiere además a métodos de detección, vacunas, agentes terapéuticos, y métodos de diagnóstico que usan las secuencias de la presente invención.

Técnica antecedente

Los pestivirus causan enfermedades altamente contagiosas y a menudo fatales de cerdos, vacas y ovejas, que se caracterizan por el daño a las vías respiratorias y gastrointestinales y del sistema inmune y pueden llevar un curso agudo o crónico. La infección del sistema reproductor puede causar muerte embrionaria y fetal, defectos congénitos y el nacimiento de animales persistentemente infectados. Los brotes de las enfermedades asociadas con infecciones por pestivirus se producen en muchos países y pueden causar grandes pérdidas económicas.

El género Pestivirus de los Flaviviridae comprende tres especies miembros estructural, antigénica y genéticamente muy relacionadas: fiebre porcina clásica (CSF) o cólera porcino (Francki et al. 1991. Flaviviridae, en el Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Archiv. Virol. Supl. 2, Springer Verlag, Viena pág. 223-233.); virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) que afecta principalmente al ganado vacuno, y el virus de la enfermedad de Border (BDV), que afecta principalmente a las ovejas (Moennig y Plagemann (1992) Adv. Virus Res. 41: 53-98; Moormann et al., (199) Virology 177: 184-198; Becher et al. (1994) Virology 198: 542-551). Estudios recientes indican que puede haber varios virus menos reconocidos que justifican la clasificación taxonómica separada, quizás como especies separadas (Avalos-Ramirez et al. (21) Virology 286: 456-465).

Los genomas de los pestivirus consisten en una molécula de ARN de hebra positiva de aproximadamente 12,5 kb (Renard et al. (1985) DNA 4: 429-438; Moormann y Hulst (1988) Virus Res. 11: 281-291; Becher et al. (1994) Virology 198: 542-551). Sin embargo, los genomas de ARN de cadena positiva de varias cepas de BVDV citopatogénicas pueden ser considerablemente más grande (Meyers et al. (1991) Virology 18: 62-616; Meyers et al. (1992) Virology 191: 368-386; Qi et al. (1992) Virology 189: 285-292).

Una propiedad inherente de virus con un genoma de ARN de cadena positiva es que su ARN genómico es infeccioso, es decir, después de la transfección de este ARN en células que soportan la replicación viral, se produce virus infeccioso. Como era de esperar, el ARN genómico (viral) de pestivirus también es infeccioso (Moennig y Plagemann, (1992) Adv. Virus Res. 41: 53-98).

En 23 se produjo un brote de muertes fetales y pre-destete de lechones en dos granjas en Nueva Gales del Sur, Australia (McOrist et al., (24) Aust Vet J. 82: 59-511). Las principales características de los hallazgos de presentación y patología clínica sugirieron que este brote de la enfermedad era nuevo y probablemente debido a un virus. Numerosos ensayos en busca de virus conocidos y algunas bacterias no lograron identificar un agente etiológico. Para evitar confusión con otras enfermedades importantes en cerdos, se atribuyó la expresión "síndrome de miocarditis porcina" (abreviado como "PMC") a la enfermedad, y se dio la expresión "virus PMC" dado al presunto agente. Posteriormente, el agente causante se identificó como un nuevo pestivirus. Se propone el nombre Bungowannah para este nuevo virus.

La presente invención aborda la necesidad en la técnica de métodos para detectar y/o tratar infecciones causadas por el nuevo virus PMC.

Sumario de la invención

La invención proporciona una secuencia de nucleótidos aislada de ARN correspondiente a la secuencia de nucleótidos del virus PMC representada en la SEC ID N21,o secuencias sustancialmente homologas a la SEC ID N2 1, o fragmentos de la misma.

La invención también proporciona la secuencia de nucleótidos aislada de ADN del virus PMC de la SEC ID N2 1, o secuencias sustancialmente homologas a la SEC ID N21, o fragmentos de la misma.

La invención proporciona además polipéptidos codificados por las secuencias de nucleótidos de ARN y ADN anteriores y fragmentos de las mismas, y/o una secuencia de aminoácidos aislada del virus PMC que se muestra en SEC ID N2 2 y fragmentos de la misma.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de una secuencia de aminoácidos del virus PMC en una muestra, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener una secuencia de aminoácidos del virus PMC con un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos del virus PMC en condiciones que permitan la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y la secuencia de aminoácidos del virus PMC; y

b) detectar la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y la secuencia de aminoácidos del virus PMC en la muestra, donde la detección de la formación de complejos de reacción indica la presencia de secuencia de aminoácidos del virus PMC en la muestra.

La invención también proporciona métodos para detectar la presencia de un anticuerpo contra el virus PMC en una muestra, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener un anticuerpo contra el virus PMC con una secuencia de aminoácidos en condiciones que permitan la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo contra el virus PMC y la secuencia de aminoácidos; y

b) detectar la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y la secuencia de aminoácidos en la muestra, donde la detección de la formación de complejos de reacción indica la presencia de anticuerpos contra el virus PMC en la muestra.

Adicionalmente, la invención proporciona un método in vitro para evaluar el nivel de anticuerpos contra el virus PMC en una muestra biológica que comprende las etapas de:

a) detectar la formación de complejos de reacción en una muestra biológica de acuerdo con el método indicado anteriormente; y

b) evaluar la cantidad de complejos de reacción formados, correspondiendo dicha cantidad de complejos de reacción al nivel de anticuerpos contra el virus PMC en la muestra biológica.

La invención también proporciona un método in vitro para evaluar el nivel de polipéptidos de virus PMC en una muestra biológica que comprende las etapas de:

a) detectar la formación de complejos de reacción en una muestra biológica de acuerdo con el método indicado anteriormente; y

b) evaluar la cantidad de complejos de reacción formados, correspondiendo la cantidad de complejos de reacción al nivel de polipéptido de virus PMC en la muestra biológica.

La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia o ausencia de virus PMC en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

a) poner la muestra biológica en contacto con una sonda o cebador polinucleotídico que comprende un polinucleótido de virus PMC de la invención en condiciones adecuadas de hibridación; y

b) detectar cualquier dúplex formado entre la sonda o cebador y el ácido nucleico en la muestra.

La presente invención también se refiere a un método para la detección de ácidos nucleicos del virus PMC presentes en una muestra biológica, que comprende:

a) amplificar el ácido nucleico con al menos un cebador como se ha definido anteriormente,

b) detectar los ácidos nucleicos amplificados.

La presente invención también se refiere a un método para la detección de ácidos nucleicos del virus PMC presentes en una muestra biológica, que comprende:

a) hibridar los ácidos nucleicos de la muestra biológica en condiciones apropiadas con una o más sondas como se ha definido anteriormente,

b) lavar en condiciones apropiadas, y

c) detectar los híbridos formados.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la generación de anticuerpos que comprende las etapas de:

a) proporcionar una secuencia de polipeptídica de virus PMC a un sujeto; y

b) recoger los anticuerpos generados en el sujeto contra el polipéptido.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende un polipéptido de virus PMC o fragmento del mismo. La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende un nucleótido del virus PMC o fragmento del mismo que codifica para un polipéptido del virus PMC.

Se proporcionan adicionalmente por la invención composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido del virus PMC que potencia la inmunocompetencia del individuo hospedador... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN del virus PMC que se une al ácido nucleico de PMC en condiciones rigurosas de hibridación caracterizada por que dicha secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN del virus PMC consiste en:

a) la SEC ID N2 11, en la que cuando la secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN es una secuencia de nucleótidos de ARN, los nucleótidos de timidina (t) están sustituidos con nucleótidos de uridina (u);

b) una secuencia de ARN o ADN que tiene al menos un 9 % de identidad de secuencia sobre al menos 1 nucleótidos con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID N211; o

c) una secuencia de nucleótidos de ARN o ADN que comprende el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

2. Un método para detectar la presencia o la ausencia de ácidos nucleicos del virus PMC en una muestra biológica, incluyendo el método las etapas de:

a) poner la muestra biológica que contiene ácido nucleico en contacto con una sonda polinucleotídica o un cebador que comprenden una secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en condiciones rigurosas de hibridación; y

detectar cualquier dúplex formado entre la sonda o el cebador y los ácidos nucleicos en la muestra.

3. Un método para la detección de ácidos nucleicos del virus PMC presentes en una muestra biológica, incluyendo el método las etapas de:

a) amplificar los ácidos nucleicos con al menos un cebador que comprende una secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN de acuerdo con la reivindicación 1, y

b) detectar las secuencias de nucleótidos amplificadas.

4. Un método para la detección de ácidos nucleicos del virus PMC presentes en una muestra biológica, incluyendo el método las etapas de:

a) hibridar los ácidos nucleicos de la muestra biológica en condiciones rigurosas de hibridación con una o más sondas que comprenden una secuencia aislada de nucleótidos de ARN o ADN de acuerdo con la reivindicación

1,

b) lavar en condiciones apropiadas, y

c) detectar los híbridos formados.

5. Un método para explorar el tejido de sujetos para ácidos nucleicos del virus PMC, comprendiendo el método las etapas de:

a) extraer el ADN del tejido ex vivo;

b) escindir con enzimas de restricción dicho ADN;

c) someter a electroforesis los fragmentos; y

d) someter a transferencia de Southern el ADN genómico de los tejidos y a posterior hibridación en condiciones rigurosas de hibridación con una secuencia de nucleótidos de ADN clonada marcada de acuerdo con la reivindicación 1.