Ensayo y procedimiento para la evaluación de la biodegradabilidad rápida de aguas mediante Pseudomonas putida.

Ensayo y procedimiento para la evaluación de la biodegradabilidad rápida de aguas mediante Pseudomonas putida.

La invención consiste en un nuevo kit y procedimiento de evaluación de la "biodegradabilidad rápida" de aguas contaminadas. El test se basa en el empleo de unas cápsulas que contienen una proporción adecuada de bacteria Pseudomonas putida liofilizada y sales minerales que se añaden al agua cuya biodegradabilidad desea evaluarse. Durante tres días de incubación a 30°C, se monitoriza la Demanda Química de Oxígeno (DQO) y se calcula la eficiencia de biodegradabilidad al final del ensayo.

Este test está dirigido al sector del tratamiento de efluentes acuosos, especialmente de origen industrial para realizar el seguimiento de la biodegradabilidad. El método resuelve los problemas de repetibilidad y tiempo de ensayo de los métodos tradicionales.

ENSAYO Y PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACIïN DE LA BIODEGRADABILlDAD RïPIDA DE AGUAS MEDIANTE PSEUDOMONAS PUTlDA.

Sector de la tïcnica La presente invenciïn estï dirigida al sector del tratamiento de efluentes acuosos, especialmente de origen industrial.

DESCRIPCiïN GENERAL DE LA INVENCiïN

La invenciïn consiste en un nuevo kit y un nuevo procedimiento de evaluaciïn de la "biodegradabilidad rïpida" de aguas contaminadas. Este kit consiste en cïpsulas de la bacteria Pseudomonas putida liofilizada y sales minerales que se aïaden al agua cuya biodegradabilidad desea evaluarse. Se mide la Demanda Quïmica de Oxïgeno (DQO) y se calcula la eficiencia de biodegradabilidad a los tres dïas de incubaciïn a 30ï (,

El kit se aplica al seguimiento de la biodegradabilidad de efluentes acuosos y para el control de influentes en Estaciïn Depuradora de Aguas Residuales Industriales (EDARI) . Las alternativas para evaluar la biodegradabilidad en aguas propuestas por la OCDE e ISO (Zahn-Wellens, relaciïn DBOs/DQO, respirometrïa, etc.) se basan en la utilizaciïn de fangos activos y presentan numerosos inconvenientes en cuanto a su aplicabilidad. Este mïtodo resuelve los problemas de repetibilidad y tiempo de ensayo de los mïtodos tradicionales.

Estado de la tïcnica En las ïltimas dïcadas, la cantidad de compuestos orgïnicos que persisten en el medioambiente se ha visto considerablemente incrementada. Paralelamente, la comunidad cientïfica ha ido desarrollando mïtodos para investigar y controlar los procesos de biodegradaciïn y proporcionar el conocimiento adecuado para la toma de decisiones en materia de protecciïn medioambiental. La mayorïa de los esfuerzos se han concentrado en la biodegradaciïn de los compuestos orgïnicos en el medio acuïtico, fundamentalmente en los procesos de tratamiento de aguas residuales, por ser un parïmetro clave para estimar los riesgos a largo plazo en la biota. Estos mïtodos deben realizarse preferentemente con un coste mïnimo, por lo que una forma preliminar de evaluar quï productos son peligrosos para el medioambiente es hacer un estudio sencillo de su biodegradabilidad.

Las pruebas de biodegradabilidad mïs empleadas internacionalmente son las propuestas por la Organizaciïn para la Cooperaciïn y el Desarrollo Econïmico (OCDE) . En estas pruebas estïn basadas otras tïcnicas estandarizadas por la Organizaciïn Internacional de Normalizaciïn (ISO) o por la Agencia deProtecciïn Ambiental de los Estados Unidos (EPA) , entre otras.

Segïn la OCDE (OCDE Cuidelines for the Testing of Chemicals, Parïs, Francia (1992) ) debe estudiarse primero la biodegradabilidad aerobia mediante una prueba de "biodegradabilidad rïpida" y en caso de que el resultado sea negativo la biodegradabilidad puede determinarse mediante una prueba de simulaciïn. De forma alternativa puede realizarse una prueba para detectar la "biodegradabilidad inherente" ya que los ensayos de "biodegradabilidad rïpida" son mïs rigurosos. En todos los casos, dicha organizaciïn aconseja que los ensayos sean realizados preferiblemente bajo condiciones realistas para simular el comportamiento de un medioambiente particular (ej. estaciïn depuradora de aguas residuales (E DAR) , aguas superficiales, suelos o sedimentos) .

Los test de la OCDE (OCDE Cuidelines for the Testing of Chemicals, Parïs, Francia (1992) ) que pueden usarse para determinar la "biodegradabilidad rïpida" de sustancias orgïnicas o aguas residuales son los test OECD nï 301 A-F: Test de pïrdida de Carbono Orgïnico Disuelto (COD) (TC 301 A) , Test de evoluciïn del CO2 (TC 301 B) , Test MITI modificado (1) (TC 301 C) , Test en botella cerrada (TC 301 D) , Test de selecciïn OCDE modificado (TC 301 E) YTest de respirometrïa manomïtrica (TC 301 F) .

Los ensayos de "biodegradabilidad rïpida" se realizan en condiciones aerobias empleando altas concentraciones de COD (2-100 mg COD/U de la sustancia cuya biodegradabilidad es objeto de estudio como ïnica fuente de carbono (excepto la fuente de carbono asociada con la biomasa) . El agua contaminada se incuba durante 28 dïas con una concentraciïn 5 relativamente baja de microorganismos (104-108 CFU/mU no adaptados al contaminante. La biomasa procede de fangos activos, efluentes secundarios de depuradora, extracto de suelo o agua superficial a los que se aïade un medio mineral especïfico. Se mantiene la incubaciïn en condiciones aerobias a temperaturas entre 20 y 25ïC y a pH neutro. El periodo puede aumentarse por encima de 28 dïas si la degradaciïn ha comenzado pero no lOse ha estabilizado (OCDE Cuidelines for the Testing of Chemicals, Parïs, Francia (1992) ) .

Los test de "biodegradabilidad rïpida" son pruebas muy versïtiles que pueden emplearse para un amplio nïmero de contaminantes debido a que la medida de biodegradabilidad se realiza monitorizando parïmetros globales. Un ejemplo de parïmetro global es el 15 COD, que es proporcional a la concentraciïn de compuestos orgïnicos presentes y estï limitado a describir la oxidaciïn total permaneciendo invariable cuando no existe oxidaciïn o es muy pequeïa. Otros parïmetros son relacionados con la respiraciïn microbiana como la Demanda Biolïgica de Oxïgeno (DBO) o la producciïn de diïxido de carbono que indirectamente proporcionan datos sobre la degradaciïn del

contaminante.

Se considera que el compuesto es rïpidamente biodegradable si se elimina un 70% del COD (TC 301 A Y TC 301 E) , un 60% del diïxido de carbono teïrico (ThC02) (TC 301 B) o un 60% de la demanda de oxïgeno teïrica (ThDO) (TC 301 C, TC 301 O Y TC 301 25 F) . Estos niveles lïmite de biodegradaciïn deben alcanzarse en una "ventana de 10 dïas" durante los 28 dïas de duraciïn del test (excepto en el ensayo TC 301 C) . La "ventana de 10 dïas" comienza cuando el grado de biodegradaciïn ha alcanzado el 10% de eliminaciïn del COD, ThDO o ThC02• Si el resultado es positivo puede considerarse como indicativo de que el contaminante serï rïpidamente biodegradado en la mayorïa de ambientes, incluidas las EDAR (OCDE Cuide lines for the Testing of Chemicals, Parïs, Francia (1992) ) .

La evoluciïn de un compuesto quïmico en una EDAR tambiïn puede estudiarse en el laboratorio usando los ensayos de simulaciïn del tratamiento aerobio de aguas residuales (OCDE, 1992) : Unidad de fangos activos (TG 303 A) Y Biofilms (TG 303 B) . Para ello, se monitorizan los cambios en el COD y/o la DQO para una concentraciïn inicial recomendada de entre 10 Y 20 mg/L. Sin embargo muchos compuestos normalmente se presentan a menores concentraciones por lo que son necesarias tïcnicas analïticas mïs sofisticadas. Estos test de simulaciïn ofrecen datos de biodegradaciïn bajo unas condiciones medioambientales especïficas mediante el uso de biomasa autïctona y sïlidos (fangos activos, sedimentos, suelos, etc.) que permiten la adsorciïn del contaminante a la temperatura tïpica que representa el ambiente particular.

Las pruebas de "biodegradabilidad inherente" presentan una elevada capacidad de degradaciïn. Permiten tiempos prolongados de exposiciïn de la sustancia a los microorganismos, se emplea una baja relaciïn sustancia evaluada/biomasa y se aïade normalmente una fuente de carbono adicional, por lo que ofrecen mïs posibilidades de obtener un resultado positivo que los test de "biodegradabilidad rïpida". Algunos de estos test incluso utilizan microorganismos adaptados para incrementar el grado de biodegradaciïn. Por ello, si el resultado es positivo no puede asumirse que la sustancia problema vaya a degradarse rïpidamente en el medioambiente.

Los mïtodos de biodegradabilidad inherente mïs utilizados son los ensayos 302 A (SCAS modificado) , 302 B (Zahn-Wellens/EMPA) y 302 C (MITI 11 modificado) (OCDE, 1992) . De todos los ensayos, el 302 A presenta mayor capacidad de biodegradaciïn con un tiempo de ensayo de hasta 6 meses de duraciïn, en el que la sustancia a evaluar (20mg COD/U es biodegradada por fangos activos empleando un efluente domïstico como fuente de carbono adicional. El ensayo de Zahn-Wellens se realiza siguiendo el consumo de COD durante 28 dïas y empleando una elevada concentraciïn de sustancia problema (50400mgCOD/U. Enel ensayo MITI 11 modificado (el de menor capacidad de biodegradaciïn) se expone al contaminante a microorganismos provenientes de un mezcla de muestras naturales de aguas superficiales, fangos activos, suelo, etc. durante 30 dïas. En todos los casos las concentraciones de biomasa son mucho mïs elevadas que en las pruebas de "biodegradabilidad rïpida" (del orden de 1 g STS (sïlidos totales en suspensiïn) /U.

Una biodegradaciïn por encima del 20% de la teïrica (COO, OQO o OBO) se considera como evidencia de "biodegradabilidad inherente primaria" mientras que por encima... [Seguir leyendo]

1. La invenciïn consiste en el encapsulamiento de una proporciïn adecuada de bacteria P. putida liofilizada como microorganismo patrïn y una mezcla de sales minerales. Cada cïpsula contiene un gramo de bacteria liofilizada y 0, 16 g de NH4C1, 0, 16 g de K2HP04, 0, 16 g de KH2P04, 0, 16 g de MgS04ï 7H20, 0, 11 g de CaCl2ï2H20, 0, 11 g de MnS04ïH20, 0, 08 g de Fe (NH4) 2 (S04) 2ï6H20, 0, 02 g de ZnS04ï7H20 y 0, 02 g de ïcido n itrilotriacïtico.

2. El procedimiento para evaluar la biodegradabilidad rïpida de aguas mediante el

mïtodo objeto de protecciïn consiste en: a) Preparaciïn de un inïculo de P. putida mediante disoluciïn y homogeneizado del contenido de la cïpsula preparada segïn la reivindicaciïn 1 en 10 mL de una disoluciïn estïril de NaCl al 0, 9%. b) Inoculaciïn de 50 mL del agua objeto de anïlisis (ajustada a pH 7 Y esterilizada mediante filtraciïn) con 1, 5 mL del inïculo previamente descrito, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad a 30ïC de temperatura y agitaciïn orbital. c) Muestreo y medida de la DQO. Repetir cada 24 h durante 3-5 dïas hasta obtener un valor constante de DQO (variaciïn inferior al 10% entre dos dïas consecutivos) . d) Determinaciïn de la biodegradabilidad rïpida mediante el cïlculo de la eficiencia de biodegradaciïn:

DQOï - (DQOI -DQOm)

El = ï100

DQOï donde DQDï es la DQO inicial aportada por la materia orgïnica presente en el agua contaminada, DQO I es la DQO medida al final del ensayo y DQOm es la DQO remanente obtenida de un ensayo blanco.