El epítopo de CD43 específico de la leucemia aguda y del linfoma linfoblástico y sus usos.

Un polipéptido aislado que es un epítopo de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

1 y que tiene menos de 100 aminoácidos de longitud, donde el epítopo de CD43 se expresa específicamente en timocitos, el subgrupo de precursores hematopoyéticos de la medula ósea, células de leucemia aguda, células blásticas de leucemia crónica con crisis blástica y células de linfoma linfoblástico.

El epítopo de CD43 específico de la leucemia aguda y del linfoma linfoblástico y sus usos Campo de la invención La presente invención se refiere a un epítopo de CD43 expresado en las células de leucemia humana aguda y linfoma linfoblástico y su uso. Más concretamente, la presente invención se refiere a un epítopo de CD43 expresado en las células de leucemia humana aguda y del linfoma linfoblástico, pero no en las células hematopoyéticas maduras y las células madre hematopoyéticas, y a sus aplicaciones diagnósticas y terapéuticas en la leucemia aguda y el linfoma linfoblástico.

Antecedentes de la invención La molécula CD43, también llamada sialoforina o leucosialina, es una molécula de la superficie celular expresada en la mayoría de las células hematopoyéticas a excepción de los eritrocitos. La CD43 humana tiene un dominio extracelular similar a la mucina de 235 aminoácidos (aa) , un dominio transmembrana de 23 aa y un dominio intracitoplasmático de 123, todos ellos codificados por un exón (Pallant et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1989, 86:1328- 32; Shelley et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1989, 86:2819-23) . El dominio extracelular de la CD43 humana es rico en los aminoácidos serina (46 residuos) y treonina (47 residuos) , la mayoría del cual lleva cerca de 80 cadenas de carbohidratos 0-ligados. Además, la CD43 contiene una cadena de carbohidratos N-ligados. La estructura de estos O-glicanos varía de un tipo de célula a otro (Carlsson et al., JBiol Chem. 1986, 261:12787-95) .

El gen CD43 se compone de dos exones, separados por un intrón de 378 pb, por lo que el producto completo de la traducción se codifica por el segundo exón (Shelley et al., Biochem J. 1990, 270:569-76) . Se ha pensado que CD43 es un marcador específico de tipo leucocito restringido a la mayoría de los leucocitos, las plaquetas y las células madre hematopoyéticas, a excepción de los eritrocitos (Remold-O'Donnell et al., Blood. 1987, 70:104-9; Fukuda, Glycobiology. 1991, 1:347-56) . Sin embargo, la expresión de CD43 en células tumorales humanas de origen no hematopoyético, como en una línea celular de cáncer de cuello de útero humano (CaSKI) , una línea celular de cáncer de pulmón humano (A549) , una línea celular de adenocarcinoma de mama humano (MCF7) , una línea celular de fibrosarcoma humano (HT 1080) , y las líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano (COLO 205, HT 29, Caco-2, DLD-1 y SW480) , ha sido demostrada (Fernández - Rodríguez et al., Tumor Biol. 2002 23:193-201) . CD43 también se expresa en el tejido de cáncer de colon humano (Sikut et al, Int J Cancer. 1999, 82:52-8; Jung et al, Korean J Pathol 38:8-14) .

Los estudios biosintéticos muestran que el precursor de CD43, de un tamaño previsto de alrededor de 40 kDa (incluyendo un N-glicano) , migra con una masa molecular aparente de 54 kDa tras la electroforesis. Este precursor se convierte posteriormente en una molécula glicosilada madura con un tamaño desde 115 kDa hasta más de 200 kDa debido a la glicosilación variable. Los timocitos , los linfocitos T CD4+ y los monocitos expresan más una isoforma 115 kDa, mientras que una forma 130 kDa se encuentra principalmente en células T CD4+ activadas, en células T CD8' en reposo y activadas, en neutrófilos , en plaquetas y en células B (Rosenstein et al., Immunol Res. 1999, 20:89-99) . Parece que más de una isoforma puede coexpresarse en la superficie de la misma célula. Un patrón de O-glicosilación postraduccional estrictamente regulado tiene como resultado estas isoformas de peso molecular característico que se expresan diferencialmente en distintos tipos celulares. Especialmente, la expresión del núcleo 2 β-1, 6-N-acetilglucosaminiltransferasa (C2GnT) resulta en la expresión de la isoforma de 130 kDa de CD43 en los timocitos y las células T (Piller et al., J.Biol Chem. 1988, 263:15146-50) .

Hasta hace poco, se han descrito más de 17 anticuerpos anti-CD43 humano. La mayoría de estos anticuerpos reaccionan con epítopos de carbohidratos en el dominio extracelular y todos los anticuerpos anti-CD43 conocidos detectar la proteína CD43 expresada en las células hematopoyéticas maduras (Tabla 1) . Por lo tanto, no son eficientes en la detección o erradicación de las células de leucemia o linfoma.

TABLA 1

Anticuerpo Células CD43 positivas Células CD43 negativas Epítopo *Referencia

anti-CD4

T305 Células T CD4+ activadas, células T CD8+, timocitos, Granulocitos, eritrocitos, Carbohidrato del 1, 2

precursores mieloides en plaquetas núcleo-2

la médula ósea

L10 Células T, timocitos, líneas Eritrocitos

de células B, monocitos, 1-78 resistente a la

neutrófilos, plaquetas sialidasa 3

L2 1-78

Células T, timocitos, líneas

de células B, monocitos, Eritrocitos

neutrófilos, plaquetas

84-3C1 Células de la médula ósea, Carbohidrato

timocitos, células T, Plaquetas, eritrocitos sensible a la 4

monocitos, granulocitos sialidasa

MEM-59 La mayoría de los Carbohidrato

leucocitos, células demédula ósea CD43+ la sensible a neuraminidasa la 5, 6

MT-1, L60 Células T, monocitos Células B

Carbohidrato 7

DFT1 Células T, monocitos Células B sensible a la

neuraminidasa

1G10 Células T, células NK, Células B, eritrocitos 8

granulocitos

CBF.78 Células T, subjonjuntos de Resistente a la

monocitos y granulocitos neuraminidasa

RDF7AD-, Células T, monocitos, Células B Carbohidrato

granulocitos sensible a la 9

neuraminidasa

161-46 Células T, monocitos, Células B Resistente a la

granulocitos neuraminidasa

4D2 COLO 205, K562, Jurkat (337-343) 10

intercelular

4D1 Células T CD4+ activadas, Células B Carbohidrato del Mukasa et

monocitos núcleo-2 al., 1999

*1. Fox et al., J Immunol. 1983, 131: 762-7; 2. Saitoh et al., Blood. 1991, 77: 1491-9; 3. Remold-O'Donnell et al., Blood. 1987, 70: 104-9; 4. Borche et al., Eur Jlmmunol. 1987, 17: 1523-6; 5. Stefanova et al., Folia Biol (Praha) . 1988, 34: 255-65; 6. Alvarado et al., Eur J Immunol. 1995, 25: 1051-5; 7. Stross et al, J Clin Pathol. 1989, 42: 95361; 8. Horejsi et al., 1997, In Kishimoto T, et al, Leucocyte Typing, Vol. VI: White Cell Differentiation Antigens 494. Garland, New York and London; 9. Tkaczuk et al., Tissue Antigens. 1999, 54: 1-15; 10. Sikut et al., Int J Cancer. 1999, 82: 52-8; 11. Mukasa et al, Int Immunol. 1999, 11: 259-68.

Compendio de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un epítopo de CD43 asociado a la leucemia aguda, la leucemia crónica con crisis blástica y linfoma linfoblástico donde el epítopo está expuesto en las células de leucemia aguda humana y el linfoma linfoblástico, pero no en las células hematopoyéticas maduras y células madre hematopoyéticas. Por lo tanto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado del epítopo de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y siendo de longitud menor de 100 aminoácidos, donde el epítopo de CD43 se expresa específicamente en timocitos, en un subconjunto de precursores hematopoyéticos en la médula ósea, células de leucemia aguda, células blásticas de leucemia crónica con crisis blástica y linfoma linfoblástico.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar material que reconoce el epítopo de CD43. Por lo tanto, la presente invención proporciona el anticuerpo o sus fragmentos que se une específicamente a un epítopo de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Un tercer objeto de la presente invención es proporcionar un método para la producción de los materiales que reconocen el epítopo de CD43. Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo o sus fragmentos que se unen a un péptico que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Un cuarto objeto de la presente invención es proporcionar material para el diagnóstico de leucemia aguda , leucemia crónica con crisis blástica, y el linfoma linfoblástico.

Un quinto objeto de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico de la leucemia aguda, la leucemia crónica con crisis blástica , y el linfoma linfoblástico. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar la leucemia aguda que comprende células de leucemia en una muestra biológica con un anticuerpo anti-epítopo de CD43, y la detección de la reacción positiva del anticuerpo anti-epítopo de CD43. La presente invención proporciona un método para diagnosticar la leucemia crónica con crisis blástica que comprende la incubación de células de leucemia en una muestra biológica con un anticuerpo anti-epítopo de CD43, y... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que es un epítopo de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que tiene menos de 100 aminoácidos de longitud, donde el epítopo de CD43 se expresa específicamente en timocitos, el subgrupo de precursores hematopoyéticos de la medula ósea, células de leucemia aguda, células blásticas de leucemia crónica con crisis blástica y células de linfoma linfoblástico.

2. El polipéptido aislado según la reivindicación 1 que tiene menos de 50 aminoácidos de longitud.

3. El polipéptido aislado según la reivindicación 1, donde el epítopo de CD43 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

4. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un epítopo de CD43 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

5. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

6. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el epítopo de CD43 está expuesto específicamente en los timocitos, el subgrupo de precursores hematopoyéticos de la medula ósea, células de leucemia aguda, células blásticas de leucemia crónica con crisis blástica y células de linfoma linfoblástico, pero no en células hematopoyéticas maduras, células troncales hematopoyéticas, y células no hematopoyéticas.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el anticuerpo se produce inmunizando de un animal con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y seleccionando el anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

9. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

10. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 9, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o animal.

11. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado.

12. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el anticuerpo o el fragmento del mismo está etiquetado con el compuesto seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, material fluorescente, material luminiscente, enzimas, y material teñido.

13. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el anticuerpo o fragmento del mismo está unido a un material toxico seleccionado del grupo que consiste en radioisótopos, productos químicos tóxicos, proteínas tóxicas y agentes antitumorales.

14. El anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 13, donde el anticuerpo o fragmento del mismo se combina con las proteínas tóxicas para producir una proteína de fusión.

15. Una célula que produce el anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

16. Un método de diagnostico de la leucemia aguda que comprende incubar células de leucemia en una muestra biológica con el anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, y detectar la reacción inmune positiva del anticuerpo anti-epítopo de CD43.

17. El método de diagnostico de leucemia aguda según la reivindicación 16, donde la detección de la reacción inmune positiva se podría confirmar utilizando un dispositivo que detecta la reacción enzimática, fluorescencia, luminiscencia o radiación.

18. Un método de diagnóstico de la leucemia crónica con crisis blástica que comprende incubar las células de leucemia en una muestra biológica con un a anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, y detectar la reacción inmune positiva del anticuerpo anti-epítopo de CD43.

19. Un método de diagnóstico del linfoma linfoblástico que comprende incubar células de linfoma en una muestra biológica con anticuerpos anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, y detectar la reacción inmune positiva del anticuerpo anti-epítopo de CD43.

20. Uso de un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la leucemia aguda.

21. Uso de un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 20, donde el anticuerpo anti-epítopo de

CD43 está unido a un material tóxico seleccionado del grupo que consiste en radioisótopos, productos químicos 5 tóxicos, proteínas tóxicas o agentes antitumorales.

22. Uso de un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la leucemia crónica con crisis blástica.

23. Uso de un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del linfoma linfoblástico.

24. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la leucemia aguda que comprende un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

25. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la leucemia crónica con crisis blástica que comprende un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, y un vehículo 15 aceptable para uso farmacéutico.

26. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento del linfoma linfoblástico que comprende un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

27. Un kit de diagnostico para leucemia o linfoma que comprende un anticuerpo anti-epítopo de CD43 según la 20 reivindicación 4 o la reivindicación 5.