Dispositivo electródico para la detección de ácido glucónico, procedimiento de fabricación y uso de dicho dispositivo.

La presente invención consiste en un dispositivo electródico para la detección de ácido glucónico,

con tres electrodos, uno de referencia, otro de trabajo y otro auxiliar, obtenidos todos ellos por serigrafía, el área activa del electrodo de referencia incluye tinta de plata/cloruro de plata, la del contraelectrodo tinta de carbono y la del electrodo de trabajo con una tinta de carbono que incorpora tetratiafulvaleno (TTF) al 3%, sobre una lámina plástica de poliéster, modificándose el área activa del trabajo con la enzima GADH utilizando un agente bifuncional en presencia de seroalbúmina bovina (BSA), así como su procedimiento de fabricación y su uso en la detección citada, de manera simple, con bajo coste y en relativo corto tiempo de análisis.

OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se enmarca en el campo de la electroquímica aplicada al análisis químico.

Asi, la presente invención se refiere a un dispositivo constituido por un sistema electródico para la detección de ácido glucónico, con tres electrodos, obtenidos todos los electrodos por serigrafia, modificándose uno de ellos posteriormente con una enzima, asi como, su procedimiento de fabricación y condiciones de uso en la detección citada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las celdas electroquímicas son de gran interés en el análisis de sustancias debido a su robustez, fabricación sencilla y económica.

Una de las técnicas más utilizadas para la fabricación de los electrodos que se utilizan en las celdas electroquímicas es la serigráfica. Esta técnica permite construir sensores químicos con una reproducibilidad y una infraestructura mínima.

La serigrafia es un método de impresión directa, también llamado de impresión por penetración. La deposición de tintas se realiza capa a capa sobre un sustrato. La calidad de los sensores químicos asi

fabricados depende, en gran medida, de los materiales utilizados.

Mediante la tecnología de electrodos serigrafiados es posible la miniaturización de los sensores ofreciendo la ventaja de ser versátiles, pueden ser fabricados con distintas configuraciones de electrodos y con diferentes tintas, y tener bajo coste pudiendo asi prestarse para la producción en masa de electrodos desechadles. Además, pueden ser utilizados para análisis in situ.

Para aumentar la selectividad de los electrodos se modifican por diferentes métodos, por ejemplo inmovilizando una sustancia, frecuentemente un enzima, en su superficie que responda selectivamente a determinados analitos. La selectividad y la acción catalítica de las reacciones enzimáticas potencian la selectividad y sensibilidad de los dispositivos.

El método de inmovilización es muy importante ya que va a influir en el tiempo de vida del sensor, en su sensibilidad y reproducibilidad. Asi, hay distintos tipos de inmovilización: por absorción, por microencapsulación, por atrapamiento, por entrecruzamiento utilizando un agente bifuncional, y por unión covalente.

Tradicionalmente, la determinación de ácido glucónico y sus metabolitos se ha realizado mediante técnicas cromatográficas, normalmente acopladas a detectores de electroforesis, espectroscopia de infrarrojo, UV/Vis, quimioluminiscencia y fluorescencia. Estas técnicas de ensayos implican instalaciones costosas y procedimientos largos, complicados y

tediosos. De forma muy minoritaria se ha determinado también por técnicas electroquimicas utilizando electrodos convencionales no desechables.

La presente invención solventa estas desventajas mediante un dispositivo electródico, cuya simplicidad, bajo coste y su relativo corto tiempo de análisis, comparado con las técnicas cromatográficas, ha supuesto un gran avance en su empleo en muchos campos.

En el caso del ácido glucónico, teniendo en cuenta los grupos funcionales presentes en su molécula susceptibles de sufrir reacciones de óxido-reducción, puede ser analizado por técnicas electroquimicas tales como voltamperometria cíclica, voltamperometria de onda cuadrada y diferencial de impulsos con acumulación, y cronoamperometria.

La utilización de mediadores, añadidos a la celda electroquímica junto con el electrolito soporte permite disminuir el potencial de uso, contribuyendo a evitar interferencias y han sido frecuentemente utilizados. El potencial redox del tetratiafulvaleno (TTF) en torno a 100 mV, hace de este analito un candidato adecuado para ser utilizado como mediador en el campo de los biosensores electroquímicos. Sin embargo, la insolubilidad de esta sustancia ha limitado su uso a las disoluciones no acuosas. Este problema se puede solventar incorporando el TTF a la tinta de serigrafiado, originando asi una pasta conductora con mediador incorporada para el serigrafiado directo del electrodo de trabajo.

La enzima gluconato deshidrogenasa (en adelante GADH), interacciona específicamente con el ácido

glucónico catalizando la deshidrogenación del mismo. La inmovilización de esta enzima sobre un electrodo serigrafiado permite poner a punto un dispositivo que aúna las ventajas de los dispositivos electródicos serigrafiados desechables con el uso de enzimas especificas para la detección de ácido glucónico.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención queda establecida y caracterizada en las reivindicaciones independientes, mientras que las reivindicaciones dependientes describen otras caracteristicas de la misma.

El objeto de la invención es un dispositivo electródico, su procedimiento de fabricación y uso del mismo para la detección de ácido glucónico. El problema a resolver es constituir el dispositivo, llevar a cabo su fabricación y usarlo, todo ello de manera simple, con bajo coste y en relativo corto tiempo de análisis, comparado con las técnicas cromatográficas conocidas.

A la vista de lo anteriormente enunciado, la presente invención se refiere a un dispositivo electródico para la detección de ácido glucónico obtenido por serigrafia caracterizado por que comprende tres electrodos, cada electrodo consta de un contacto o borne, un tramo y un área activa, siendo uno de referencia, otro de trabajo, y otro auxiliar o contraelectrodo, constituidos los bornes y los tramos con una tinta de plata, el área activa del electrodo de referencia con una tinta de plata/cloruro de plata, el área activa del contraelectrodo con un tinta de carbono y el área activa del electrodo de trabajo con una tinta de carbono a la que se ha incorporado previamente

tetratiafulvaleno, al 3%, sobre una lámina plástica de poliéster, estando el electrodo de trabajo modificado posteriormente de manera que se inmoviliza el enzima GADH en su superficie utilizando un agente bifuncional 5 como el glutaraldehido en presencia de seroalbúmina bovina (BSA).

Opcionalmente el dispositivo incluye un aislante que cubre el dispositivo, dejando libre los contactos y 10 áreas activas de los electrodos.

Asimismo, la presente invención se refiere a un proceso de fabricación del dispositivo anteriormente mencionado que comprende las siguientes etapas:

-serigrafiado de una lámina de poliéster con tinta de plata con las formas de los contactos y los tramos de los tres electrodos,

-serigrafiado del área activa del electrodo de 20 referencia con Ag/AgCl,

-serigrafiado del área activa del contraelectrodo con carbono,

-serigrafiado de un aislante cubriendo el dispositivo, excepto el área activa de los electrodos y los bornes 25 de los mismos,

-serigrafiado del área activa del electrodo de trabajo con pasta de carbono a la que se ha incorporado TTF al

Do /

-modificación del área activa del electrodo de trabajo 30 mediante inmovilización de la enzima GADH en su

superficie.

Y, la presente invención se refiere al uso del dispositivo anteriormente mencionado con la opción del 35 aislante, que comprende las siguientes etapas:

-introducción del dispositivo en una celda

electroquímica que contiene 5 mL de una disolución

tampón de dihidrogenofosfato sódico con pH 6, 100 mM y KC1 100 mM,

-unión de los contactos de los electrodos a un potenciostato,

-aplicación de un potencial de 0.100 V entre el

electrodo de trabajo y el contraelectrodo,

-espera a estabilización de corriente,

-adición de 50 pL de disolución problema de ácido

glucónico,

-sucesivas adiciones de 50 pL de disolución de ácido glucónico de concentración de 12.48 hasta 108.00 pM, -registro de las intensidades de corriente en función del tiempo,

-representación de la recta de calibrado,

-extrapolación de dicha recta de calibrado para calcular la concentración de ácido glucónico en la muestra problema.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Se complementa la presente memoria descriptiva, con un juego de figuras, ilustrativas del ejemplo preferente y nunca limitativas de la invención.

La figura 1 muestra el esquema de la reacción electródica en la que interviene el mediador TTF y la enzima GADH.

La figura 2 representa una vista en alzado de

los electrodos sin aislante.

La figura 3 representa una vista en alzado de

los electrodos con un aislante.

EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En la realización aqui detallada y mostrada en las figuras, la invención se refiere a un dispositivo electródico para la detección de ácido glucónico, con tres electrodos (1, 2, 3), obtenidos todos... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo electródico para la detección de

ácido glucónico obtenido por serigrafia caracterizado por que comprende tres electrodos (1, 2, 3), cada

electrodo consta de un contacto o borne (1.3, 2.3, 3.3), un tramo (1.2, 2.2, 3.2) y un área activa (1.1, 2.1,

3.1), siendo uno de referencia (1), otro de trabajo (2), y otro auxiliar o contraelectrodo (3), constituidos los bornes (1.3, 2.3, 3.3) y los tramos (1.2, 2.2, 3.2) con una tinta de plata, el área activa del electrodo de

referencia (1.1) con una tinta de plata/cloruro de plata, el área activa del contraelectrodo (3.1) con un tinta de carbono y el área activa del electrodo de

trabajo (2.1) con una tinta de carbono que incorpora tetratiafulvaleno (TTF) al 3%, sobre una lámina plástica de poliéster, estando el electrodo de trabajo (2)

modificado de manera que se inmoviliza la enzima GADH en su superficie utilizando un agente bifuncional en presencia de seroalbúmina bovina (BSA).

2. Dispositivo electródico según la

reivindicación 1 que incluye un aislante (4) que cubre el dispositivo, dejando libre los contactos (1.3, 2.3,

3.3) y áreas activas (1.1, 2.1, 3.1) de los electrodos

(1, 2, 3).

3. Dispositivo electródico según la

reivindicación 1 en el que los contactos (1.3, 2.3,

3.3) , los tramos (1.2, 2.2, 3.2) y el área activa (1.1)

del electrodo de referencia (1) tienen forma

rectangular.

4. Dispositivo electródico según la

reivindicación 3 en el que el área activa (1.1) del

electrodo de referencia (1) tiene forma rectangular de 2 mm de anchura por 4 mm de longitud.

5. Dispositivo electródico según la

contraelectrodo (3) tiene una anchura entre 1,4 y 1,5 mm, un tramo recto de entre 3 y 5 mm, que conecta con un arco de radio entre 3 y 5 mm.

7. Proceso de fabricación del dispositivo según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

-serigrafiado de una lámina de poliéster con tinta de plata con las formas de los contactos (1.3, 2.3, 3.3) y los tramos (1.2, 2.2, 3.2) de los tres electrodos (1, 2, 3),

-serigrafiado del área activa (1.1) del electrodo de referencia (1) con Ag/AgCl,

-serigrafiado del área activa (3.1) del contrelectrodo (3) con una pasta de carbono, -serigrafiado de un aislante (4) cubriendo el dispositivo excepto el área activa (1.2, 2.2,

3.2) de los electrodos (1, 2, 3) y los bornes (1.1, 2.1, 3.1) de los electrodos (1, 2, 3), -serigrafiado del área activa (2.1) del electrodo de trabajo (2) con una pasta de carbono a la que se ha incorporado TTF al 3%,

-modificación del área activa (2.1) del electrodo de trabajo (2) mediante la inmovilización del

enzima GADH en su superficie.

8. Proceso de fabricación según la reivindicación 7 en el que la inmovilización de la enzima GADH se lleva a cabo mediante entrecruzamiento con glutaraldehido y seroalbúmina bovina.

durante 90 minutos a una temperatura de 4°C.

10. Uso del dispositivo según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

-introducción del dispositivo en una celda electroquímica que contiene 5 mL de una solución tampón de dihidrogenofosfato sódico con pH 6.0, 100 mM y KC1 100 mM,

-unión de los contactos (1.3, 2.3, 3.3) de los

electrodos a un potenciostato,

-aplicación de un potencial de 0.100 V entre el electrodo de trabajo (2) y el contraelectrodo

(3) ,

-espera a estabilización de corriente,

-adición de 50 pL de disolución problema de ácido glucónico,

-sucesivas adiciones de 50 pL de disolución de ácido glucónico de concentración de 12.48 hasta 108.00 pM,

-registro de las intensidades de corriente,

-representación de la recta de calibrado, -extrapolación de dicha recta de calibrado para calcular la concentración de ácido glucónico en la muestra problema.