Procedimiento de detección en tiempo real de microorganismos en un medio de cultivo líquido por aglutinación.

Procedimiento de detección en un contenedor de al menos un microorganismo susceptible de estar presente en una muestra,

que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto en dicho contenedor: un medio de cultivo que permita el crecimiento y/o la detección de los microorganismos, dicha muestra y un soporte sólido sensibilizado;

b) someter el conjunto a una temperatura que favorezca el crecimiento y/o la detección de los microorganismos; y

c) observar en tiempo real, en el interior de dicho contenedor y simultáneamente al crecimiento del o de los microorganismos, la aparición de una aglutinación que indique la presencia del o de los microorganismos o que confirme dicha presencia cuando dichos microorganismos son detectados en dicho medio de cultivo, al final de la etapa b).

Procedimiento de detección en tiempo real de microorganismos en un medio de cultivo líquido por aglutinación El campo de la invención es el del control microbiológico clínico o industrial. Más particularmente, se trata de un método que permite identificar uno o varios microorganismos mediante una reacción de aglutinación efectuada simultáneamente con el enriquecimiento de la muestra en microorganismos.

El análisis microbiológico necesita unas técnicas precisas y cuyo tiempo de obtención del resultado debe ser lo más corto posible.

En el campo médico, es necesario prever y diagnosticar el riesgo infeccioso: cuanto más rápido y preciso sea el diagnóstico, más eficaz será el tratamiento de los enfermos y más minimizado estará el riesgo de transmisión. El enfoque es similar para la salud animal.

En el campo agroalimenticio, las condiciones son idénticas. Distingue sin embargo los microorganismos patógenos y sus toxinas, cuya búsqueda se aplica a los productos comercializados, los microorganismos no patógenos, utilizados como indicadores de calidad del proceso de producción, desde los productos brutos hasta los productos finales, a lo largo de la cadena, y las bacterias de interés tecnológico, tales como los fermentos. La detección rápida y precisa de presuntas contaminaciones permite controlarlas e iniciar así acciones correctivas.

Técnicamente, el análisis microbiológico puede aplicar una o varias fases de pre-enriquecimiento/enriquecimiento, una o varias fases de detección, una o varias fases de enumeración de los microorganismos. Para aplicaciones particulares, tales como el control microbiológico agroalimenticio, puede requerirse también una fase de confirmación, a fin de responder a las normas en vigor en este campo.

La fase de pre-enriquecimiento/enriquecimiento recurre a medios de cultivo, selectivos o no, bien conocidos por el experto en la materia. Están disponibles comercialmente unos medios de cultivo listo para su uso, frecuentemente en forma líquida, basados en fórmulas de medios tradicionales.

La fase de detección se basa en la puesta en evidencia de los caracteres metabólicos de los microorganismos buscados. Se utilizan clásicamente unos sustratos enzimáticos específicos. Estos sustratos enzimáticos están generalmente compuestos de dos partes, una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar, denominada también parte diana, y una segunda parte que sirve de marcador, denominada parte marcador, generalmente constituida por un cromóforo o un fluoróforo. Mediante la selección de estos sustratos, según si hay reacción o no, es posible caracterizar la naturaleza de un microorganismo o discriminar diferentes grupos de microorganismos. Así, la aparición o la desaparición de una coloración o de una fluorescencia será la firma de un género o de un tipo de microorganismos. Para ello, la utilización de medios cromógenos permite la detección y la identificación simultáneas de los gérmenes buscados. Esta simplifica el proceso y disminuye sustancialmente el tiempo de obtención del resultado. Se citarán a título de ejemplo concreto los medios ChromID® de la solicitante. Estos medios cromógenos están basados en la detección de caracteres metabólicos específicos de los gérmenes buscados como, por ejemplo, la actividad enzimática beta-glucuronidasa para Escherichia coli. Sin embargo, algunos microorganismos, o algunos sub-tipos como por ejemplo Escherichia coli O157:H7, no presentan actividad enzimática específica, y no pueden por lo tanto ser detectados con la ayuda de un medio de cultivo cromógeno.

La fase de confirmación, por su parte, está más particularmente relacionada con el análisis microbiológico en el campo agroalimenticio. En efecto, cuando el resultado de los métodos desarrollados anteriormente es positivo, es necesario confirmar la presencia del patógeno buscado. Esto impone un ensayo complementario y la utilización de un principio de detección diferente del utilizado durante el primer análisis. Las técnicas de biología molecular, basadas en los caracteres genómicos de los microorganismos buscados, constituyen uno de los medios utilizados para confirmar la identificación. A título de ejemplo, se citarán las técnicas de amplificación clásicas tales como la PCR (Polymerase Chain Reaction) y la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) , que pueden ser acopladas a técnicas de detección en tiempo real conocidas por el experto en la materia.

Los inmuno-ensayos constituyen otra de las tecnologías utilizadas para el ensayo de confirmación. Hacen uso de las características inmunógenas de los microorganismos buscados. De manera no exhaustiva, se pueden citar las técnicas ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) , por competición o de tipo sándwich, o las técnicas de inmunoaglutinación, detectando unos epítopos de los microorganismos buscados. Estos últimos recurren a unos soportes sólidos funcionalizados, tales como unas perlas (por ejemplo unas partículas de látex) recubiertas de anticuerpos monoclonales o policlonales, siendo dichos soportes funcionalizados puestos en contacto con una muestra biológica, como se indica por ejemplo en las patentes europeas concedidas EP 0 701 624 y EP 1 199 567. Alternativamente, como se describe en la patente US-4, 659, 658, las partículas sólidas pueden estar recubiertas de lectinas, que se une específicamente a unos azúcares situados en la superficie de un microorganismo dado. El documento US5217715 describe un método que consiste en fijar un receptor hidrocarbonado N-acetilalactosaminabeta-1, 4-galactosa-beta-1, 4-glucosa sobre un soporte insoluble que puede ser utilizado para la detección de bacterias en un ensayo de aglutinación. En todo caso, la aparición de la aglutinación permite identificar de manera

segura el microorganismo buscado.

La identificación completa y precisa de un microorganismo en una muestra necesita por lo tanto el enlace de varias etapas: enriquecimiento, detección, confirmación. La estandarización de los ensayos utilizados rutinariamente ha permitido la automatización de los métodos de detección, que siguen siendo, no obstante, largos de llevar a cabo. Un inconveniente del estado de la técnica es, en efecto, que estas etapas son realizadas de manera secuencial. Otro inconveniente es que la reacción de interacción específica utilizada para la etapa de confirmación, reacción inmunológica o reacción de hibridación molecular es, generalmente, leída en "punto final". Durante este tiempo, en la industria agroalimenticia, la totalidad del lote del producto final está bloqueada esperando el resultado de confirmación, y en términos clínicos, se retrasan el establecimiento de la antibioterapia pertinente y de las medidas de prevención.

A la vista del estado de la técnica considerado, falta por lo tanto un procedimiento que combine las etapas de enriquecimiento, de detección y de identificación precisa. Concretamente, tal procedimiento conjugaría rapidez, especificidad y sensibilidad.

La presente invención propone por lo tanto paliar los inconvenientes descritos antes utilizando simultáneamente un cultivo de los microorganismos y al menos una reacción de aglutinación en medio líquido.

De manera más precisa, la invención se refiere en primer lugar a un procedimiento de detección y de identificación de al menos un microorganismo susceptible de estar presente en una muestra, que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto en un contenedor: un medio de cultivo que permita el crecimiento y/o la detección de los microorganismos, dicha muestra y un soporte sólido sensibilizado;

b) someter el conjunto a una temperatura que favorezca el crecimiento y/o la detección de los microorganismos;

c) observar en tiempo real la aparición de una aglutinación que indique la presencia del o de los microorganismos o que confirme dicha presencia cuando dichos microorganismos se detectan en dicho medio de cultivo, al final de la etapa b) .

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de detección y de identificación de al menos un microorganismo susceptible de estar presente en una muestra, que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto en un contener: un medio de cultivo que permita el crecimiento y/o la identificación de los microorganismos, dicha muestra y un soporte sólido sensibilizado;

b) someter el conjunto a una temperatura que favorezca el crecimiento y/o la identificación de los microorganismos;

c) observar en tiempo real la aparición de una aglutinación que permita realizar la identificación del o de los microorganismos o confirmar dicha identificación, cuando el... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección en un contenedor de al menos un microorganismo susceptible de estar presente en una muestra, que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto en dicho contenedor: un medio de cultivo que permita el crecimiento y/o la detección de los microorganismos, dicha muestra y un soporte sólido sensibilizado;

b) someter el conjunto a una temperatura que favorezca el crecimiento y/o la detección de los microorganismos; 10 y c) observar en tiempo real, en el interior de dicho contenedor y simultáneamente al crecimiento del o de los microorganismos, la aparición de una aglutinación que indique la presencia del o de los microorganismos o que confirme dicha presencia cuando dichos microorganismos son detectados en dicho medio de cultivo, al final de la etapa b) .

2. Procedimiento de detección y de identificación en un contenedor de al menos un microorganismo susceptible de estar presente en una muestra, que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto en dicho contenedor: un medio de cultivo que permita el crecimiento y/o la identificación de los microorganismos, dicha muestra y un soporte sólido sensibilizado;

b) someter el conjunto a una temperatura que favorezca el crecimiento y/o la identificación de los microorganismos; y c) observar en tiempo real, en el interior de dicho contenedor y simultáneamente al crecimiento del o de los microorganismos, la aparición de una aglutinación que permita realizar la identificación del o de los microorganismos o que confirme dicha identificación, cuando dicho o dichos microorganismos son identificados en dicho medio de cultivo, al final de la etapa b) .

3. Procedimiento de detección y de identificación en un contenedor único de al menos un microorganismo susceptible de estar presente en una muestra, que comprende las etapas que consisten en:

a) poner en contacto en un contenedor: un medio de cultivo que permita el crecimiento y la identificación de los 35 microorganismos, dicha muestra y un soporte sólido sensibilizado;

b) someter el conjunto a una temperatura que favorezca el crecimiento y la identificación de los microorganismos; y c) observar en tiempo real, en el interior de dicho contenedor y simultáneamente al crecimiento del o de los microorganismos, la aparición de una aglutinación que permita completar la identificación del o de los microorganismos, realizada al final de la etapa b) .

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección o la identificación en el medio 45 de cultivo utiliza la aparición o la desaparición de una coloración o de una fluorescencia.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la aglutinación se pone en evidencia por la aparición o la desaparición de una coloración o de una fluorescencia.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el contenedor se toma del grupo constituido por las microplacas, las microcúpulas, los microtubos, los capilares o las placas de múltiples pocillos.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de enumeración de los microorganismos. 55

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción de aglutinación aplica una reacción antígeno-anticuerpo.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la reacción de aglutinación aplica una reacción 60 de tipo fago-proteína bacteriana.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la reacción de aglutinación aplica una reacción de tipo ligando/antiligando.