Procedimiento de cultivo para favorecer la producción de vitamina K2 por las bacterias lácticas y sus aplicaciones en la preparación de productos alimenticios.

Procedimiento para aumentar la cantidad de vitamina K2 obtenida cultivando por lo menos una cepa de bacteria láctica productora de vitamina K2,

en el que el cultivo de dicha cepa se realiza en unas condiciones de "resting cells", comprendiendo dicho procedimiento por lo menos:

a) el precultivo de dicha cepa en unas condiciones de respiración, en un medio de precultivo apropiado que contiene por lo menos una porfirina con una concentración final de por lo menos 0,5 μg/ml;

b) la inoculación de un medio de cultivo apropiado que contiene por lo menos 0,5% de materia grasa con una cantidad de células bacterianas vivas que varía de 108 a 1011 ufc/ml aproximadamente; y,

c) la fermentación del medio así inoculado durante un periodo que varía de 4 a 48 horas, a una temperatura de 4ºC a 50ºC, de tal manera que al final de la etapa c), la cantidad de vitamina K2 producida por el cultivo de "resting cells" es superior, en un factor por lo menos igual a aproximadamente 1,2 a la obtenida cultivando dicha cepa en unas condiciones de fermentación estándar.

Procedimiento de cultivo para favorecer la producción de vitamina K2 por las bacterias lácticas y sus aplicaciones en la preparación de productos alimenticios.

La presente invención se refiere al campo de los productos alimenticios ricos en nutrientes, vitaminas y/u oligoelementos para mejorar el contenido y el equilibrio cualitativo y cuantitativo de la aportación de nutrientes en el ser humano.

Diferentes procedimientos industriales que utilizan micro-organismos permiten producir unos metabolitos 10 secundarios a gran escala (Demain AL. et al, Science 1981)

La invención se interesa en los medios para enriquecer los alimentos con vitamina K.

De manera más precisa, la presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar la cantidad de vitamina 15 K2 obtenida al cultivar por lo menos una cepa de bacteria láctica productora de vitamina K2, en el que dicha cepa se cultiva en unas condiciones de "resting cells", de tal manera que la cantidad de vitamina K2 producida por el cultivo de célula en "resting cells" es superior, en un factor por lo menos igual a aproximadamente 1, 2, a la obtenida al cultivar dicha cepa en unas condiciones de fermentación estándar.

Además, la presente invención se refiere a la biomasa obtenida de un cultivo de una bacteria láctica productora de vitamina K2 de acuerdo con el procedimiento anteiror.

La invención también se refiere a un procedimiento para producir vitamina K2, a unos procedimientos para preparar productos alimenticios, en particular productos fermentados y/o productos lácteos frescos, enriquecidos en vitamina 25 K2, así como a los productos alimenticios así obtenidos.

La vitamina K es una vitamina soluble en grasa que se presenta en dos formas naturales: vitamina K1 (o filoquinona) y vitamina K2 (o menaquinona)

La vitamina K1 es sintetizada por las plantas. Se encuentra principalmente en los vegetales verdes (vegetales con hojas) y el aceite de soja.

La vitamina K1 actúa de manera más directa en el proceso de coagulación de la sangre.

La vitamina K2, por su parte, está producida por las bacterias de la flora intestinal. También aparece en pequeñas cantidades en ciertos alimentos después de la fermentación (queso, productos asiáticos típicos tales como el miso y el natto Japonés, a base de soja fermentada, etc.) . Muchas bacterias son capaces de sintetizar la vitamina K2. De esta manera, además de las bacterias de la flora intestinal y, en particular, las especies Escherichia coli, Bacillus subtilis y Bacteroides spp., se pueden citar ciertas especies o subespecies de bacterias lácticas tales como 40 Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis spp. cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides y Propionibacterium sp. La cantidad de vitamina K2 sintetizada por estas bacterias generalmente varía de 29 a 90 Îg/l aproximadamente de leche fermentada (Morishita et al., 1999) . Es importante acentuar que las mediciones de producción de vitamina K2 generalmente se realizan a partir de liofilizados de residuos celulares y los resultados de estas mediciones revelan una gran heterogeneidad de los niveles de producción en función de las cepas probadas, 45 pudiendo incluso triplicarse (Morishita et al., 1999; Parker et al., 2003) . En términos de actividad biológica, la vitamina K2 es conocida sobre todo por su acción en la calcificación de los tejidos suaves.

La vitamina K ha sido descrita inicialmente por su papel esencial en el proceso de coagulación de la sangre. De esta manera, grandes deficiencias en vitamina K provocan hemorragias, con alargamiento anormal del tiempo de 50 coagulación, y equimosis. Se ha creído durante mucho tiempo que las grandes deficiencias en vitamina K eran mÂs bien raras en el adulto, pudiendo estar las necesidades cubiertas en principio de manera satisfactoria por una dieta variada y equilibrada y gracias a la producción endógena de la vitamina por bacterias cólicas. A este respecto, las personas en riesgo son típicamente:

- los recién nacidos, cuyos intestinos no tienen al nacer las bacterias productoras de vitamina K;

- las personas cuyas funciones hepáticas, biliares o intestinales están perturbadas (enfermedades hepáticas, mucoviscidosis, colitis, disenterías, etc.) ; y, 60

- quienes toman antibióticos a largo plazo.

De manera más reciente, se descubrió que el impacto de la vitamina K en la salud del ser humano no se limitaba a su papel en los mecanismos de coagulación sanguínea. De hecho, desde los años 80, la vitamina K también se ha reconocido por su papel en el metabolismo óseo (Hart et al., 1984; Hart et al., 1985) . 65

Esta vitamina juega el papel de cofactor en una reacción enzimática que condiciona la actividad de la osteocalcina en el contexto de regulación de formación ósea (Hauschka PV et al., 1989; Ducy P et al., 1996) . Su papel de manera más precisa consiste en condicionar la carboxilación de la osteocalcina, una proteína clave que regula el proceso de formación ósea. En el caso de deficiencia de vitamina K, esta reacción no tiene lugar, provocando un aumento en la proporción sanguínea entre osteocalcina descarboxilada y osteocalcina carboxilada (VÃÃnÃnen et al., 1999) . 5

La evolución demográfica en los países occidentales se ha traducido en un envejecimiento progresivo de la población, asociado consecuentemente a un aumento de la prevalencia de las patologías degenerativas, en particular de la osteoporosis. Por esta razón, la osteoporosis se reconoce desde entonces como un problema principal de salud pública. 10

Las estimaciones demográficas establecidas en los años 90 hicieron sonar la alarma al prever un aumento considerable de la incidencia de esta patología en los siguientes 50 años, en particular entre los de más edad. De esta manera se impuso rápidamente la necesidad y la urgencia de emprender acciones para prevenir esta patología, hasta entonces raramente investigada y tratada de manera tardía. 15

Desde entonces, se ha reconocido que la prevención de la osteoporosis debe comenzar en la infancia, a través de un crecimiento óseo óptimo, y continuar toda la vida manteniendo la masa ósea. Se sabe que los factores nutricionales juegan un papel importante en el desarrollo y el mantenimiento del patrimonio óseo. Hasta ahora, las estrategias nutricionales contempladas o propuestas para prevenir la osteoporosis recaen principalmente en dos 20 factores clave que son el calcio y la vitamina D. Sin embargo, se sabe en la actualidad que otros factores nutricionales podrían ser de importancia notable.

Debido a su papel principal en la formación ósea, la vitamina K aparece cada vez más en la bibliografía como una vía prometedora para conservar la salud ósea del ser humano a lo largo de toda su vida. 25

Las aportaciones nutricionales recomendadas de vitamina K en el ser humano (1, 5 Îg/d/kg de peso) se han establecido teniendo en cuenta solamente su papel en los fenómenos de coagulación. Ahora bien, unos estudios recientes sugieren que estas aportaciones nutricionales recomendadas se subestiman finalmente si se tiene en cuenta asimismo la actividad de vitamina K en el metabolismo óseo (Ronden et al., 1998) . 30

Aunque todavía se desconocen las necesidades de vitamina K, no por ello es menos cierto que una baja aportación está asociada a una baja masa ósea y a un riesgo aumentado de fracturas en el adulto (Hart et al., 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et al., 2000) . Además, los estudios de intervención en las mujeres menopáusicas mostraron que la vitamina K podía permitir disminuir las pérdidas óseas en este grupo objetivo (Shiraki et al., 2000; 35 Braam et al., 2003) . Por último, unos estudios en animales sugieren que podría jugar un papel favorable durante el pico de masa ósea y esto, aún mejor en caso de asociación sinérgica con la vitamina D. Sin embargo, los estudios que claramente conectan la vitamina K y el crecimiento óseo se han emprendido en la actualidad solamente en animales.

Además, unos estudios recientes han proporcionado unos argumentos adicionales en favor del impacto de la vitamina K en el metabolismo óseo y, en particular, en la constitución y la preservación de la masa ósea (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano e Ishi, 2002) .

Contrariamente al adulto, pocos datos están disponibles con respecto a los efectos benéficos de la vitamina K en EL 45 metabolismo óseo del niño. Solamente se sabe que es esencial optimizar la masa ósea durante el periodo de crecimiento, para constituir una reserva ósea máxima y proteger al adulto contra el riesgo de osteoporosis futura.

En cualquier caso, se desprende del conjunto... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para aumentar la cantidad de vitamina K2 obtenida cultivando por lo menos una cepa de bacteria láctica productora de vitamina K2, en el que el cultivo de dicha cepa se realiza en unas condiciones de "resting cells", comprendiendo dicho procedimiento por lo menos: 5

a) el precultivo de dicha cepa en unas condiciones de respiración, en un medio de precultivo apropiado que contiene por lo menos una porfirina con una concentración final de por lo menos 0, 5 Îg/ml;

b) la inoculación de un medio de cultivo apropiado que contiene por lo menos 0, 5% de materia grasa con una 10 cantidad de células bacterianas vivas que varía de 108 a 1011 ufc/ml aproximadamente; y,

c) la fermentación del medio así inoculado durante un periodo que varía de 4 a 48 horas, a una temperatura de 4º C a 50º C, de tal manera que al final de la etapa c) , la cantidad de vitamina K2 producida por el cultivo de "resting cells" es superior, en un factor por lo menos igual a aproximadamente 1, 2 a la obtenida cultivando 15 dicha cepa en unas condiciones de fermentación estándar.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho medio de cultivo apropiado contiene por lo menos 1, 5% de grasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que dicho medio de cultivo apropiado es una leche o una leche cuyo poder tampón ha sido aumentado.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha cepa de bacteria láctica productora de vitamina K2 se selecciona de entre los géneros Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus y 25 Propionibacterium.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que dicha cepa de bacteria láctica se selecciona de entre las especies Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium, y Propionibacterium sp. 30

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que dicha cepa de bacteria láctica se selecciona de entre las variantes naturales de Lactococcus lactis subsp. cremoris productoras de vitamina K2:

- I-3557 depositada en la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25, rue 35 du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia) el 20/01/2006,

- I-3558 depositada en la CNCM (Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia) el 20/01/2006, y, 40

- I-3626 depositada en la CNCM (Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, Francia) el 19/06/2006.

7. Procedimiento para producir vitamina K2, que comprende por lo menos:

a) la realización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y, b) la recuperación de la vitamina K2 así producida.

8. Procedimiento para preparar un producto alimenticio enriquecido con vitamina K2, que comprende por lo menos:

a) la producción de vitamina K2 según el procedimiento de la reivindicación 7;

b) la adición de la vitamina K2 así producida a dicho producto alimenticio, o a una preparación intermedia del mismo; y, 55

c) la obtención de dicho producto alimenticio enriquecido con vitamina K2.

9. Procedimiento para preparar un producto alimenticio enriquecido con vitamina K2, que comprende por lo menos:

a) el cultivo de por lo menos una cepa de bacteria láctica productora de vitamina K2 en unas condiciones de 60 "resting cells" de acuerdo con el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

b) la adición de la biomasa obtenida a partir del cultivo en a) , a dicho producto alimenticio o a una preparación intermedia del mismo; y, 65

c) la obtención de dicho producto alimenticio enriquecido con vitamina K2.