Procedimiento para cultivar células mediante perfusión continua y flujo tangencial alternante.

Uso de un procedimiento de cultivo celular por perfusión en el que se hace circular un cultivo celular que comprende un medio de cultivo celular y una suspensión de células sobre un módulo de filtro que comprende fibras huecas,

en el que el flujo sobre el módulo del filtro es un flujo tangencial alternante, para la reducción de la agregación de las células en el cultivo celular, en el que estas células tienen la tendencia a formar fácil o inherentemente agregados durante el cultivo, en el que no más del 5% de las células en el cultivo forman agregados en suspensión de al menos 5 células.

Procedimiento para cultivar células mediante perfusión continua y flujo tangencial alternante La presente invención se refiere a la reducción de la agregación de células en un cultivo celular.

Kyung et al. (1994) (Cytotechnology 14, 183-190) se refiere al cultivo de densidad celular elevada de células de mamíferos, y en particular de una estirpe celular epitelial de riñón humano recombinante (indicada como la estirpe celular 293) . Estas células tienen una tendencia a agregarse, con la muerte concomitante de las células en el centro de estos agregados. Kyung et al. muestran que esta tendencia a agregarse puede ser influenciada al reducir la concentración de Ca2+ en el medio de cultivo celular. Sin embargo, incluso a una concentración muy baja de Ca2+ (100 !M) , se formaron grandes agregados durante el cultivo a lo largo de un período prolongado.

El documento WO93/05145 describe el cultivo de células de ovario de hámster chino (CHO) y la prevención de la formación de agregados en tales cultivos de células CHO. Aparte de la posibilidad de reducir la concentración de Ca2+ (lo que es indeseable debido a que los iones calcio son necesarios para el crecimiento celular) , el documento WO93/05145 describe que el control de la relación molar de iones inorgánicos totales y aminoácidos totales en el medio nutriente puede dar como resultado la reducción de la agregación de las células CHO.

La presente invención describe el uso de un procedimiento de cultivo celular por perfusión en el que un cultivo celular que comprende medio de cultivo celular y una suspensión de células se hace circular sobre un módulo de filtro que comprende fibras huecas en el que el flujo en el módulo de filtro es un flujo tangencial alternante, para la reducción del grado de agregación de las células en el cultivo celular en el que estas células tienen la tendencia a formar fácil o inherentemente agregados durante el cultivo según la reivindicación 1.

Sorprendentemente se ha encontrado que cultivando por perfusión células de animales, en particular de mamíferos,

o células de levadura según la invención, se pueden obtener densidades de células viables extremadamente elevadas, mientras que el cultivo celular presenta además una viabilidad celular extremadamente elevada. Adicionalmente, se encontró que el procedimiento de perfusión de la invención conduce a menos agregación celular en el cultivo, incluso a un cultivo que es una suspensión de células individuales sin agregados visibles. Esto es un hallazgo sorprendente debido a que el uso de condiciones de bajo cizallamiento, tales como el cultivo de células por perfusión, no conduce típicamente a la disgregación de las células. La agregación celular durante el cultivo celular por perfusión es desventajosa, debido a que es más difícil el control del procedimiento, debido, por ejemplo, a la heterogeneidad en los perfiles metabólicos de células en los agregados celulares. Esto es especialmente problemático si las células forman agregados de 5 células o más, y cuando los agregados comprenden en total 5% o más de la cantidad total de células.

En el documento US 6.544.424 se describe un procedimiento de perfusión. Aunque este documento menciona que este procedimiento puede ser usado para el cultivo de células animales por perfusión, no describe ni sugiere las densidades celulares extremadamente elevadas encontradas en la presente invención. Además, el documento 6.544.424 B1 describe que el procedimiento de perfusión podría disminuir la unión y crecimiento de una obstrucción en la superficie de membrana de las fibras huecas, pero no describe ni sugiere que las células en el propio cultivo celular se agregasen menos.

En un artículo de Furey (J. Furey, Continuous Cell Culture Using the ATF System, Genetic Engineering News, Volumen 20, Número 10, 15 de mayo de 2000, páginas 52-53) se describe el mismo procedimiento de perfusión. Se citó que el sistema de fibras huecas que se usa durante el procedimiento de cultivo por perfusión descrito allí tiene tendencia a obturarse por acumulación de partículas y gelatina sobre la superficie de la membrana, así como también que, con la recirculación del cultivo celular a lo largo del módulo de fibras huecas, las entradas de las luces de las fibras huecas se obstruirán. Se da a conocer que la aplicación de un flujo tangencial alternante evita tal obturación y ensuciamiento, pero este artículo no describe ni sugiere que las células en el propio cultivo celular se agregasen menos.

Voisier et al. (Biotechnol. Bioeng. 82 (2003) , 751-765) repasan diversas técnicas de retención celular en cultivo de perfusión de alta densidad de células de mamífero suspendidas. Ninguno de los sistemas de retención celular revisados es capaz de proporcionar las densidades de células viables extremadamente elevadas combinadas con la viabilidad celular extremadamente elevada, de la presente invención. Además, este artículo no describe ni sugiere que las células en el propio cultivo celular se agregarían menos al aplicarles un flujo tangencial alternante durante el cultivo celular.

El cultivo de células por perfusión tiene su significado convencional en la técnica, es decir, significa que, durante el cultivo, las células son retenidas por un dispositivo de separación en el que existe un flujo saliente de líquido que tiene una densidad celular menor que antes de la separación, y en el que hay un flujo entrante del medio de cultivo celular. En el procedimiento de la presente invención, el dispositivo de separación es un módulo de filtro que comprende fibras huecas.

El cultivo por perfusión incluye, pero no se limita a, flujo continuo y flujo semicontinuo, por ejemplo flujo por etapas o flujo escalonado.

Con la expresión “fibra hueca” se quiere decir una membrana tubular. El diámetro interno del tubo está preferiblemente entre 0, 3 y 6, 0 mm, más preferiblemente entre 0, 5 y 3, 0 mm, lo más preferible entre 0, 5 y 2, 0 mm. Preferiblemente, el tamaño de malla en la membrana se escoge de manera que el tamaño de los poros en la malla está próximo al diámetro de las células, asegurando una retención elevada de células mientras que el desecho celular puede pasar el filtro. Preferiblemente, el tamaño de malla está entre 3-30 !m.

Los módulos de filtro que comprenden fibras huecas están comercialmente disponibles de, por ejemplo, General Electric (antiguamente Amersham) .

Con “flujo tangencial alternante en el módulo de filtro” se quiere decir que hay un flujo en la misma dirección que (es decir, tangencial a) las superficies de membrana de las fibras huecas, flujo el cual va y viene, y que hay otro flujo en una dirección sustancialmente perpendicular a dicha superficie del filtro. El flujo tangencial se puede lograr según métodos conocidos por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, en el documento US 6.544.424 se describe que se puede lograr flujo tangencial alternante usando una bomba para hacer circular el cultivo celular sobre un módulo de filtro que comprende fibras huecas, y otra bomba para eliminar el líquido que tiene una densidad celular menor que antes de la separación con el filtro.

En el procedimiento de la invención, en principio se puede usar cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de células. Las directrices para escoger un medio de cultivo celular y las condiciones del cultivo celular son bien conocidas en la técnica, y se proporcionan por ejemplo en el Capítulo 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques) , 4ª edición 2000, Wiley-Liss y en Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell & Tissue culture: Laborator y Procedures 1993, John Wiley & Sons.

Generalmente, un medio de cultivo celular para células de mamíferos comprende sales, aminoácidos, vitaminas, lípidos, detergentes, tampones, factores de crecimiento, hormonas, citocinas, oligoelementos e hidratos de carbono. Los ejemplos de sales incluyen sales de magnesio, por ejemplo MgCl2.6H2O, MgSO4 y MgSO4.7H2O, sales de hierro, por ejemplo FeSO4.7H2O, sales de potasio, por ejemplo KH2PO4, KCl; sales de sodio, por ejemplo NaH2PO4, Na2HPO4 y sales de calcio, por ejemplo CaCl2.2H2O. Los ejemplos de aminoácidos son todos los 20 aminoácidos proteinogénicos conocidos, por ejemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Los ejemplos de vitaminas incluyen: ascorbato, biotina, colina.Cl, mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina. Los ejemplos de lípidos incluyen: ácidos grasos, por ejemplo ácido linoleico y ácido oleico; peptona de soja y etanolamina. Los ejemplos de detergentes incluyen Tween 80 y Pluronic F68. Un ejemplo de un tampón es HEPES. Los ejemplos... [Seguir leyendo]

1. Uso de un procedimiento de cultivo celular por perfusión en el que se hace circular un cultivo celular que comprende un medio de cultivo celular y una suspensión de células sobre un módulo de filtro que comprende fibras huecas, en el que el flujo sobre el módulo del filtro es un flujo tangencial alternante, para la reducción de la agregación de las células en el cultivo celular, en el que estas células tienen la tendencia a formar fácil o inherentemente agregados durante el cultivo, en el que no más del 5% de las células en el cultivo forman agregados en suspensión de al menos 5 células.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que las células agregantes son células de mamífero.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que las células de mamífero son células CHO, hibridomas, células BHK, 10 células de mieloma, células humanas o células de ratón.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que se elimina biomasa al menos una vez del cultivo celular, y se añade medio de cultivo celular adicional al cultivo celular.