Cristalización de anticuerpos anti-VEGF.

Un método de producción de cristales de bevacizumab adecuado para aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico que comprende:

a) poner en contacto bevacizumab con una solución; e

b) incubar el bevacizumab y la solución hasta que se forman cristales de bevacizumab, en el que la solución:

(i) comprende ZnCl2 de 1 a 120 mM; o

(ii) comprende ZnCl2 y tampón acetato sódico (NaOAc); o

(iii) comprende ZnCl2 y carece de otros precipitantes; o

(iv) comprende Tris 10 mM y MgCl2 50-100 mM a pH 9,0 y la incubación se realiza a temperatura ambiente; o

(v) comprende Tris 10 mM y MgCl2 100 mM a pH 9,0 y la incubación se realiza a una temperatura entre 2 ºC y temperatura ambiente.

Cristalización de anticuerpos anti-VEGF

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos monoclonales se están convirtiendo en poderosos agentes terapéuticos en el tratamiento de varias enfermedades y afecciones, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, enfermedades respiratorias, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas. Generalmente, las terapias que incluyen anticuerpos requieren la 10 administración de entre 100 mg y 1 g de anticuerpo por dosis. Un enfoque comúnmente usado para tales tratamientos es usar infusiones intravenosas de aproximadamente 2 a 20 ml de una solución de 50 mg/ml del anticuerpo. Debido a que se desean métodos de introducción distintos de la administración intravenosa, tales como inyección subcutánea, sería ventajoso tener soluciones más concentradas de los anticuerpos. Sin embargo, soluciones concentradas de los anticuerpos pueden conducir a problemas, que incluyen, pero no se limitan a, soluciones altamente viscosas, agregación de proteínas y problemas con la estabilidad de las soluciones.

Se han cristalizado fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, para su uso en cristalografía de rayos X. Procedimientos previamente informados de la cristalización de anticuerpos monoclonales han usado generalmente la técnica de difusión de vapor. Los inconvenientes de esta técnica incluyen las mínimas cantidades de cristales que 20 se producen, y el uso de agentes que en algunos casos son inaceptables para su uso en seres humanos. También pueden usarse métodos de procesos en lotes para producir cantidades ligeramente mayores de cristales. Los métodos de procesos en lotes comúnmente usados normalmente utilizan precipitantes orgánicos o poliméricos. Se han descrito protocolos que utilizan precipitantes orgánicos para cristalizar anticuerpos. Yang y col., PNAS, vol. 100, Nº 12, pág. 6934-6939 (2003) ; Kuznetsov y col., J. Cr y stal Growth, vol. 232, pág. 30-39 (2001) ; Kuznetsov y col., J.

Structural Biology, vol. 131, pág. 108-115 (2000) ; Harris y col., Immunological Reviews, vol. 163, pág. 35-43 (1998) ; Harris y col., J. Mol. Biol., vol. 275, pág. 861-872, (1998) ; y Harris y col., Proteins, vol. 23, pág. 285-89 (1995) . Ejemplos de precipitantes orgánicos o poliméricos comúnmente usados incluyen polietilenglicol (PEG) , isopropanol, Jeffamine® (Huntsman Petrochemical Corp., Sal Lake City, UT) y (+/-) -2-metil-2, 4-pentanodiol (MPD) .

Como muchos anticuerpos se procesan ahora a gran escala para la administración a seres humanos, se desea tener métodos de formación de cristales y/o geles de proteína concentrados a gran escala, especialmente aquellos que no incluyen precipitantes orgánicos o poliméricos. Los cristales y/o geles son útiles para almacenamiento y administración terapéuticamente.

Sumario de la invención

La invención proporciona métodos, como se definen en las reivindicaciones, de producción de cristales de bevacizumab adecuados para aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico.

Un aspecto de la invención proporciona un método de producción de cristales del anticuerpo que incluye las etapas de poner en contacto el anticuerpo con una solución que incluye 1 a 500 milimolar (mM) de cloruro de cinc (ZnCl2) y tampón acetato sódico 1 a 100 mM (NaOAc) ; e incubar el anticuerpo y la solución hasta que se forman cristales del anticuerpo.

En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto el anticuerpo con una solución que comprende cloruro de cinc 1 a 120 mM; e incubar el anticuerpo y la solución hasta que se forman cristales del anticuerpo. En algunas realizaciones, la incubación es a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la temperatura es de aproximadamente 20 a 27 º C. En otras realizaciones, la incubación es inferior a una temperatura de aproximadamente 20 º C, preferentemente de aproximadamente 0 a 20 º C, más preferentemente aproximadamente 0

a10º C.

En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto el anticuerpo o fragmento del mismo con una solución que comprende ZnCl2 y tampón NaOAc e incubar el anticuerpo y la solución hasta que se forman cristales del anticuerpo.

Un método de producción de cristales del anticuerpo incluye poner en contacto el anticuerpo con una solución que incluye cloruro de cinc y carece de otros precipitantes; e incubar el anticuerpo y la solución hasta que se forman cristales del anticuerpo.

En algunas realizaciones, la solución comprende cloruro de cinc (ZnCl2) 10 a 80 mM, más preferentemente 25 mM a 60 mM. En otras realizaciones, el tampón es NaOAc 1 a 20 mM, más preferentemente acetato sódico (NaOAc) 25 a 75 mM. En algunas realizaciones, la solución comprende ZnCl2 superior a 10 mM y NaOAc superior a 5 mM. Por ejemplo, la solución comprende ZnCl2 100 mM y NaOAc 10 mM. En otras realizaciones, el tampón tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, más preferentemente de aproximadamente 4, 7 a 5, 7.

También se desvela un cristal de un anticuerpo o fragmento del mismo producido mediante los métodos descritos en el presente documento. Los anticuerpos pueden ser un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado.

También se desvela una composición que incluye un cristal o un gel de proteína de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo anti-VEGF, anti-CD20, anti-CD11a, anti-CD40, anti-Apo-2, anti-HER2, anti-IgE y fragmentos de los mismos, y un vehículo. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos glucosilados de longitud completa.

También se desvela una formulación que incluye un cristal o gel de proteína de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anti-VEGF, anti-Apo-2, anti-CD20, anti-CD11a, anti-CD40, anti-HER2, anti-Apo-2, anti-IgE y fragmentos de los mismos, y al menos un componente.

También se desvela un método de tratamiento de una afección en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una de las composiciones o formulaciones anteriores. Las condiciones incluyen aquellas que están asociadas a VEGF, CD20, CD11a, CD40, Apo-2 y HER2.

También se desvela un artículo de fabricación que incluye al menos una de las composiciones o formulaciones anteriores y un recipiente.

También se desvelan métodos, composiciones y formulaciones, útiles, entre otras cosas, para concentrar, purificar, guardar y administrar anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra la solubilidad de anti-VEGF en concentraciones variables de ZnCl2 y NaOAc, pH 5, 7, temperatura ambiente. La gráfica muestra la concentración de anti-VEGF soluble representada en función de la concentración de ZnCl2 y concentraciones de NaOAc. Se muestran diferentes concentraciones de NaOAc del siguiente modo: x NaOAc 10 mM; Î" NaOAc 25 mM (línea blanca) ; â NaOAc 50 mM; â-  NaOAc 75 mM; * NaOAc 100 mM.

La Figura 2a es una imagen a 200x aumentos de cristales de anti-VEGF formados en presencia de ZnCl2 5 mM y NaOAc 100 mM, pH 5, 7 bajo luz no birrefringente.

La Figura 2b es una imagen a 200x aumentos de cristales de anti-VEGF formados en presencia de ZnCl2 5 mM y NaOAc 100 mM, pH 5, 7, bajo luz birrefringente.

La Figura 2c es una imagen a 200x aumentos de cristales de anti-VEGF formados en presencia de ZnCl2 25 mM y NaOAc 10 mM, pH 5, 7, bajo luz no birrefringente.

La Figuras 2d es una imagen a 200x aumentos de cristales de anti-VEGF formados en presencia de ZnCl2 25 mM y NaOAc 10 mM, pH 5, 7, bajo luz birrefringente.

La Figura 2e es una imagen a 200x aumentos de cristales de anti-VEGF formados en una solución de ZnCl2 10 45 mM, NaOAc 100 mM, pH 5, 7, bajo luz no birrefringente.

La Figura 2f es una imagen a 200x aumentos de cristales de anti-VEGF formados en una solución de ZnCl2 10 mM, NaOAc 100 mM, pH 5, 7, bajo luz birrefringente.

La Figura 3 muestra el mapa de fases para la condición estática generada representando la concentración de ZnCl2 contra la concentración de NaOAc. Los siguientes símbolos identifican â cristales libres; â-  transiciones de fase; Î" cristales en gel (triángulos blancos) .

La Figura 4 muestra el mapa de fases de condiciones de mezcla frente a estáticas. Los símbolos representan 55 lo siguiente: â? mezcla libre; â mezcla de gel; --â--mezcla de transición; --â- --estática de transición; â-¡ estática libre; y â-  estática del gel.

La Figura 5 muestra SDS-PAGE de cristales de anti-VEGF que se aislaron, lavaron y resolubilizaron. El carril 1 son los marcadores de peso molecular; el carril 2 es 5 μg de anti-VEGF;... [Seguir leyendo]

1. Un método de producción de cristales de bevacizumab adecuado para aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico que comprende:

a) poner en contacto bevacizumab con una solución; e b) incubar el bevacizumab y la solución hasta que se forman cristales de bevacizumab, en el que la solución:

(i) comprende ZnCl2 de 1 a 120 mM; o (ii) comprende ZnCl2 y tampón acetato sódico (NaOAc) ; o (iii) comprende ZnCl2 y carece de otros precipitantes; o (iv) comprende Tris 10 mM y MgCl.

5. 100 mM a pH 9, 0 y la incubación se realiza a temperatura ambiente; o

(v) comprende Tris 10 mM y MgCl2 100 mM a pH 9, 0 y la incubación se realiza a una temperatura entre 2 º C 15 y temperatura ambiente.

2. El método según la reivindicación 1, parte (ii) o (iii) , en el que la solución comprende ZnCl2 de 1 a 500 mM y tampón acetato sódico 1 a 100 mM (NaOAc) .

3. El método de la reivindicación 1, parte (i) o (ii) , o la reivindicación 2 como dependiente de la reivindicación 1, parte

(i) o (ii) , en donde la solución no incluye precipitantes orgánicos o poliméricos.

4. El método de la reivindicación 1, parte (i) , (ii) o (iii) , la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde la solución comprende ZnCl2 de 10 mM a 80 mM. 25

5. El método de la reivindicación 4, en el que la solución comprende ZnCl2 de 25 mM a 60 mM.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la solución comprende NaOAc de 1 mM a 100

mM. 30

7. El método de la reivindicación 6, en el que el tampón comprende NaOAc de 25 mM a 75 mM.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la solución comprende ZnCl2 superior a 10 mM

y NaOAc superior a 5 mM. 35

9. El método de la reivindicación 8, en el que la solución comprende ZnCl2 100 mM y NaOAc 10 mM.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la solución se tampona a un pH de al menos

4, 7. 40

11. El método de la reivindicación 10, en el que la solución se tampona a un pH de aproximadamente 4, 7 a 5, 7.

12. El método de la reivindicación 1, parte (iv) , en el que la concentración de MgCl2 es 50 mM.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la incubación es a temperatura ambiente.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como finalmente dependiente de la reivindicación 1, partes (i) , (ii) , (iii) o (v) , en el que la incubación es a 2-8 º C.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el anticuerpo es bevacizumab de longitud completa.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende además la etapa de:

c) combinar los cristales con vehículos y/o componentes para formar composiciones y/o formulaciones.