Compuestos de ciclooctina fusionada y su uso en reacciones clic sin metales.

Compuesto de la Fórmula (IIa):**Fórmula**

donde:

p es 0 o 1;

R3 se selecciona del grupo consistente en [(L)p -Q], hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos alquilo siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halógenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos sililo se representan con la fórmula (R4)3Si-, donde R4 se selecciona independientemente del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12 y grupos cicloalquiloxi C3 - C12, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S;

L es un grupo de unión seleccionado de grupos alquileno C1 - C24, grupos alquenileno C2 - C24, grupos alquinileno C2 - C24, grupos cicloalquileno C3 - C24, grupos cicloalquenileno C5 - C24, grupos cicloalquinileno C8 - C24, grupos alquil(hetero)arileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquenileno C8 - C24, grupos (hetero)arilalquinileno C9 - C24, los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno y grupos (hetero)arilalquinileno lineales o ramificados siendo opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos cicloalquenilo C5 - C12, grupos cicloalquinilo C8 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halógenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos sililo se pueden representar con la fórmula (R4)3Si-, donde R4 se define como anteriormente.

Compuestos de ciclooctina fusionada y su uso en reacciones clic sin metales Campo de la invención

[1] La invención se refiere a compuestos de ciclooctina fusionada y a un método para su preparación. Los compuestos de ciclooctina fusionada según la invención se pueden utilizar en las reacciones clic sin metales. Por lo tanto, la invención se refiere además a un método para la modificación de una molécula diana mediante la reacción de un conjugado de ciclooctina fusionada con una molécula diana que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno. La invención también se refiere al uso de conjugados de ciclooctina en el etiquetado bioortogonal, la formación de imágenes o la modificación de una molécula diana.

Antecedentes de la invención

[2] Un desarrollo revolucionario en el campo en rápida expansión de la "biología química" está relacionado con la química en sistemas vivos. La química en sistemas vivos comprende las reacciones químicas que son progresivas en la naturaleza, pero tan rápidas y eficientes que se producen a pH aproximadamente fisiológico, en el agua, y en la proximidad de funcionalidades biomoleculares. Tales reacciones se pueden agrupar bajo el término "química bioortogonal". En el campo de la química bioortogonal hay dos desafíos principales: primero, el desarrollo de la química adecuada, y segundo, su aplicación en organismos vivos (in vivo).

[3] En el campo de la química, una caja de herramientas enorme de reacciones químicas está disponible y se pueden aplicar a la construcción de moléculas orgánicas complejas. No obstante, la gran mayoría de tales reacciones pueden sólo llevarse a cabo bajo condiciones estrictamente anhidras, en otras palabras, en ausencia completa de agua. Aunque todavía una buena minoría de reacciones químicas se pueden realizar en agua, o en presencia de agua, la mayor parte de estas reacciones pueden sólo aplicarse aún in vitro debido a que la interferencia de otros compuestos presentes en el organismo vivo con los productos químicos implicados pueden no ser excluidos. Actualmente, sólo unas pocas reacciones químicas son completamente compatibles con otros grupos funcionales presentes en el organismo vivo.

[4] Un ejemplo de tal reacción es la cicloadición de alquinas y azidas cíclicas, una de las reacciones es conocida como "reacciones clic". Esta reacción se ha convertido en una herramienta versátil para el etiquetado bioortogonal y la formación de imágenes de biomoléculas (como por ejemplo proteínas, lípidos, gl¡canos y similares), proteómicos y ciencia de los materiales. En esencia, dos entidades moleculares separadas, una cargada con una azida, y una cargada con un cicloalquino forzado, se unen espontáneamente y forman una única molécula mediante una reacción llamada cicloadición de alquinos y azidas promovida por tensión (SPAAC). La potencia de la SPAAC para el etiquetado bioortogonal radica en el hecho de que una alquina o azida cíclica aislada es completamente inerte a las funcionalidades biológicas, como por ejemplo aminas, tioles, ácidos o carbonilos, pero en combinación sufren una cicloadición rápida e irreversible que lleva a un conjugado de triazol estable. Por ejemplo, las proteínas azidomodificadas, obtenidas por expresión en bacterias auxotróficas, ingeniería genética o conversión química, pueden ser limpiamente etiquetadas con biotina, fluoróforos, cadenas de PEG u otras funcionalidades agitando simplemente la azido-proteína con un conjugado de ciclooctina. Además, el tamaño pequeño de la azida ha demostrado ser altamente útil para la aplicación de SPAAC en la formación de imágenes de biomoléculas específicas mediante la estrategia de indicador químico.

/=\

\

/=\

\

N

O

Esquema 1

[5] Además de las azidas, las ciclooctinas también muestran una alta reactividad con otros dipolos, tales como las nitronas y los óxidos de nitrilo. Por ejemplo, la cicloadición de alquinos y nitronas promovida por tensión (SPANC) se 5 aplicó para la modificación de los /V-terminales de las proteínas.

[6] Las reacciones de cicloadición SPAAC y SPANC (esquema 1) ocurren espontáneamente, por lo tanto en ausencia de un catalizador (metal), y éstas y un selecto número de cicloadiciones adicionales son también llamadas "reacciones clic sin metales".

[7] Varias alquinas cíclicas y su aplicación en el etiquetado bioortogonal están descritas en la técnica previa. La US 29/68738 se refiere a compuestos de cicloalquino modificado y su uso en biomoléculas de modificación a través de una reacción de cicloadición que se puede llevar a cabo bajo condiciones fisiológicas. La cicloadición implica reaccionar un cicloalquino modificado, como por ejemplo compuestos de ciclooctina difluorinada DIFO, DIF2 y DIF3, con una

fracción de azida en una biomolécula diana, generando una biomolécula covalente modificada. Se observó que la sustitución del fluoruro tiene un efecto acelerador en la cicloadición con azida. Por ejemplo DIF3 muestra una velocidad de reacción constante significativamente mejorada de hasta k= 76 x 1'3 M'1 s'1, frente a un máximo de 2.4 x 1'3 M'1 s'1 en sistemas no fluorinados.

[8] WO 29/64366 divulga composiciones y métodos de uso de los mismos para etiquetar péptidos y proteínas in vitro o in vivo. Se describen los conjugados donde una ciclooctina fluorinada se conjuga a través de un enlazador de polietilenglicol con un fluoroforo (Cy3 o Alexa Fluor 568) o con biotina.

[9] Las ciclooctinas donde la ciclooctina se fusiona con grupos arilo (sistemas benzanulados) se describen en WO 29/67663, y la cinética reactiva de estos compuestos de dibenzociclooctina DIBO en la cicloadición con azidas están más mejorados (7c =.12 M'1 s'1).

[1] La azadibenzociclooctina DIBAC fue desarrollada por van Delft et al. (Chem. Commun. 21, 46, 97 - 99), y muestra además la cinética reactiva mejorada en la cicloadición con azidas (k=.31 M"1 s"1).

[11] Recientemente fue proporcionado otro sistema benzanulado, la biarilazaciclooctinona BARAC, por Bertozzi et al. (J. Am. Chem. Soc. 21, 132, 3688 - 369). Colocando la funcionalidad de la amida en el anillo, la cinética reactiva de la cicloadición de BARAC con azidas mejoró significativamente (k =.96 M"1 s"1).

[12] Se descubrió también que DIBO y DIBAC sufren cicloadición rápida con nitronas como describen Pezacki (Chem. Commun. 21, 46,931 - 933) y van Delft (Angew. Chem. Int. Ed. 21, 49, 365 - 368), con constantes de velocidad de reacción hasta 3 veces superiores a con azidas.

[13] No obstante, las sondas de ciclooctina para el etiquetado bioortogonal conocidas en la técnica anterior conllevan diferentes desventajas. Ante todo, la aplicación difundida se dificulta por el hecho de que sólo DIBAC está comercialmente disponible. La preparación sintética requiere experiencia química avanzada. Además, la síntesis de las sondas actualmente disponibles es larga (ocho pasos químicos para DIF2, diez pasos para DIF3, nueve pasos para DIBAC), y/o de producción baja (1% total para DIBO). En tercer lugar, la presencia de las dos fracciones de arilo benzanulado en DIBO y DIBAC infligen ambas repulsión estérica seria al igual que carácter lipofílico. El carácter lipofílico de DIBO y DIBAC puede llevar a la unión de proteínas inespecíficas por interacciones de van der Waals, lo cual es indeseable.

[14] Por lo tanto, existe una demanda clara de sondas bioortogonales nuevas fácilmente accesibles y reactivas para su uso en reacciones clic sin metales, tal como la cicloadición 1,3-dipolar con azidas, nitronas y otros 1,3-dipolos.

Resumen de la invención

[15] En un primer aspecto, la invención se refiere a un compuesto de la Fórmula (lia):

donde:

p es o 1;

R3 se selecciona del grupo consistente en [(L)p-Q], hidrógeno, halógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos alquilo siendo interrumpidos opcionalmente por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - Ci2, halógenos, grupos amino, grupos oxo... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de la Fórmula (lia):

donde:

p es o 1;

R3 se selecciona del grupo consistente en [(L)p -Q], hidrógeno, halógeno, grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, los grupos alquilo siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo son opcionalmente independientemente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - Ci2, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halógenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S, donde los grupos sililo se representan con la fórmula (R4)3Si-, donde R4 se selecciona independientemente del grupo consistente en grupos alquilo 1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12 y grupos cicloalquiloxi C3 - C12, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi son opcionalmente sustituidos, los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi siendo opcionalmente interrumpidos por uno de varios heteroátomos seleccionados del grupo consistente en O, N y S;

L es un grupo de unión seleccionado de grupos alquileno C1 - C24, grupos alquenileno C2 - C24, grupos alquinileno C2 - C24, grupos cicloalquileno C3 - C24, grupos cicloalquenileno C5 - C24, grupos cicloalquinileno C8 - C24, grupos alquil(hetero)arileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquileno C7 - C24, grupos (hetero)arilalquenileno C8 - C24, grupos (hetero)arilalquinileno Cg - C24, los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquil(hetero)arileno, grupos (hetero)arilalquileno, grupos (hetero)arilalquenileno y grupos (hetero)arilalquinileno lineales o ramificados siendo opcionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes independientemente seleccionados del grupo consistente en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos cicloalquenilo C5 - C12, grupos cicloalquinilo C8 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halógenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos sililo se pueden representar con la fórmula (R4)3Si-, donde R4 se define como anteriormente;

Q es un grupo funcional seleccionado del grupo consistente en hidrógeno, halógeno, R6, -CH=C(R6)2, -C-CR6, -[C(R6)2C(R6)2]q-R6, donde q está dentro del rango de 1 a 2, -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR6, -N(R6)2, -+N(R6)3, -C(X)N(R6)2, -C(R6)2XR6, -C(X)R6, -C(X)XR6, -S()R6, -S()2R6, -S()OR6, -S()2R6, -S()N(R6)2, -S()2N(R6)2, -OS()R6, -S()2R6, -OS()OR6, -S()2R6, -P()(R6)(R6), -P()(R6)2, -P()(R6)2, -Sí(R6)3, -XC(X)R6, -XC(X) XR6, -XC(X)N(R6)2, -N(R6)C(X)R6, -N(R6)C(X)XR6 y -N(R6)C(X)N(R6)2, donde X es oxígeno o azufre y donde R6 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24; y

R se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde p es 1 y L es CH2.

3. Compuesto según la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde Q se selecciona del grupo consistente en -OR6, -N(R6)2, -+N(R6)3, -C()N(R6)2, -C()R6, -C()R6, -C()R6, -C()N(R6)2, -N(R6)C()R6, -N(R )C()R y -N(R6)C()N(R6)2, donde R6 es tal y como se define en la reivindicación 1.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, donde Q es -OH.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, donde Ri es hidrógeno.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, donde R3 es hidrógeno o [(L)pQ].

7. Compuesto según la reivindicación 2, donde Q es -OH, R1 es hidrógeno y R3 es hidrógeno o [(L)pQ].

8. Compuesto según la reivindicación 7, donde el compuesto es el de la Fórmula (exo-lla.2) o (endo-lla.2):

9. Conjugado donde un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 se conjuga con una etiqueta a través de un grupo funcional Q.

1. Conjugado según la reivindicación 9, donde el grupo funcional Q se conecta a la etiqueta a través de una unidad de conexión de la estructura Q-S-Q, donde Q se define como en la reivindicación 1, y donde S se selecciona del grupo consistente en grupos alquileno Ci - C2oo, grupos alquenileno C2 - C2, grupos alquinileno C2 - C2oo, grupos cicloalquileno C3 - C2o, grupos cicloalquenileno C5 - C2, grupos cicloalquinileno C8 - C2, grupos alquilarileno C7 - C2, grupos arilalquileno C7 - C2oo, grupos arilalquenileno C8 - C2, grupos arilalquinileno Cg - C2o, donde opcionalmente los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquinileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquinileno, grupos alquilarileno, grupos arilalquileno, grupos arilalquenileno y grupos arilalquinileno son sustituidos, y donde opcionalmente dichos grupos se interrumpen por uno o varios heteroátomos, dichos heteroátomos siendo seleccionados del grupo que consiste en O, S y NR6, donde R6 se define como en la reivindicación 1.

11. Conjugado según la reivindicación 9 o reivindicación 1, donde, en el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, p es 1, L es CH2, R1 es H y R3 es H.

12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde la etiqueta se selecciona del grupo que comprende fluoróforos, biotina, cadenas de polietilenglicol, cadenas de polipropilenglicol, cadenas mixtas de polietilenglicol/polipropilenglicol, isótopos radiactivos, esteroides, compuestos farmacéuticos, lípidos, péptidos, glicanos, nucleótidos y etiquetas peptídicas.

13. Método para preparar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, el método comprende las etapas de:

(a) Ciclopropanación de un ciclooctadieno de la Fórmula (VIla):

H H

(Vlla)

donde:

R1 se selecciona independientemente del grupo consistente en hidrógeno,

grupos alquilo Ci - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 -

C24;

para formar un compuesto de cicloocteno biciclico,

(b) Brominación del compuesto obtenido de cicloocteno biciclico para formar un compuesto de ciclooctano biciclico, y

(c) Deshidrobrominación del compuesto obtenido de ciclooctano biciclico para formar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8.

14. Método para la modificación de una molécula diana, donde un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 -

12 reacciona con un compuesto que comprende un 1,3-dipolo o un 1,3-(hetero)dieno.

15. Método según la reivindicación 14, donde el compuesto que comprende un 1,3-dipolo es un compuesto que comprende azida, un compuesto que comprende nitrona o un compuesto que comprende óxido de nitrilo.

16. Uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 para el etiquetado bioortogonal, la formación de imágenes o la modificación de una molécula diana.

17. Composición que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 -12, que comprende además 25 un portador farmacéuticamente aceptable.