Compuestos de acridinio con alto rendimiento cuántico y sus usos en mejoramiento de la sensibilidad de ensayo.

Un inmunoensayo heterogéneo mejorado para la detección o cuantificación de un analito usando un compuesto de acridinio hidrofílico,

con alto rendimiento cuántico, que contiene grupos funcionales donadores de electrones en la posición C-2 y/o la posición C-7 del anillo de acridinio, donde el compuesto de acridinio con alto rendimiento cuántico tiene un rendimiento de luz cuántico relativo mayor que 1 al compararse con un compuesto de acridinio correspondiente sin grupos funcionales donantes de electrones en la posición C-2 y/o C-7 del anillo de acridinio, en cuyo caso el grupo funcional donantes de electrones se selecciona del grupo consistente en -OCH2CH2CH2SO3 - y - O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-OMe, donde n ≥ 0-5.

Compuestos de acridinio con alto rendimiento cuántico y sus usos en mejoramiento de la sensibilidad de ensayo

Antecedentes de la invención

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud con número de serie 1/26,54 presentada el 27 de septiembre de 22.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos de acridinio quimioluminiscentes con alto rendimiento cuántico, con una producción de luz incrementada. Las características estructurales necesarias para obtener emisión de luz incrementada a partir de compuestos de acridinio se divulgan en la presente. Adicionalmente, también divulgamos versiones hidrofílicas de estas estructuras, las cuales no sólo tienen producción de luz incrementada sino también tienen solubilidad de agua incrementada y bajo enlazamiento no específico. Éstos compuestos son útiles para mejorar la sensibilidad de ensayo debido a su elevado rendimiento cuántico y a su naturaleza hidrofílica.

2. Antecedentes de la invención

Los ásteres de acridinio (AEs por sus siglas en inglés) luminiscentes son etiquetas extremadamente útiles que se han usado extensamente en inmunoensayos y ensayos de ácidos nucleicos. Una reseña reciente, M.J., Journal of Cllnlcal Llgand Assay vol. 22, pp. 15-122 (1999) resume los desarrollos pasados y actuales en esta clase de compuestos quimioluminiscentes.

McCapra, F. et al., Tetrahedron Lett. vol. 5, pp.3167-3172 (1964) y Rahut et al. J. Org. Chem vol. 31, pp. 3587- 3592. (1965) divulgaron que la luminiscencia de los ásteres de sales de acridinio puede provocarse por peróxido alcalino. Desde estos estudios fundamentales se ha incrementado el interés en compuestos de acridinio debido a su utilidad como etiquetas. La aplicación del éster de acridinio bromuro de 9-carboxifenil-N-metilacridinio en un inmunoensayo fue divulgada por Simpson, J.S.A. et al., Nature vol. 279, pp. 646-647 (1979). Sin embargo, este éster de acridinio es muy inestable y por lo mismo limita su utilidad comercial. La inestabilidad surge de la hidrólisis de la unión del éster 9-carboxifenilo entre el fenol y el anillo de acridinio.

En la técnica anterior, se han descrito diferentes estrategias para incrementar la estabilidad de compuestos de acridinio. Law et al., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, vol. 4, pp. 88-89 (1989) introdujeron dos grupos metilo al flanco del residuo de éster de acridinio para estabilizar esta unión. Se encontró que el resultante éster de acridinio estabilizado de modo estérico, DMAENHS [2,6-dimetil-4-(N-succinimidiloxicarbonil)fenil 1- metilacridinio-9-carboxilato] tenía la misma producción de luz que un éster de acridinio que carecía de los dos grupos metilo. La estabilidad del anterior compuesto al conjugarse con una ¡nmunoglobulina era vastamente superior y no mostraban pérdida de actividad quimioluminiscente incluso después de una semana a 37 °C, a pH 7. En contraste, el éster de acridinio monosustituido solamente retuvo 1% de su actividad cuando se sometió al mismo tratamiento. Las patentes estadounidenses Nos. 4,918,192y 5,11,932 describen DMAEy sus aplicaciones.

El éster de acridinio estabilizado de modo estérico, DMAE-NHS ha sido utilizado comercialmente en el inmuno analizador ACS:18 (Bayer Diagnostics). La patente estadounidense No. 5,656,426 de Law et al. divulga una versión hidrofílica de DMAE denominada éster NSP-DMAE-NHS. Tanto DMAE como NSP-DMAE se usan actualmente en los inmuno analizadores ACS:18 y Advia Centaur de Bayer. Las estructuras químicas de estos compuestos y el sistema de numeración del anillo de acridinio se ¡lustran en las siguientes ilustraciones:

A'-* contraion

[1

r

o*VRi

O-SK)

Estructura general de una sulfonamida de acridinio [R2 y R3 son grupos alquilo o a rilo)

Estructura de NSP-DMAE-NHS

Debido a que el anillo de acridinio es simétrico, C-1 es equivalente a C-8, C-2 es equivalente a C-7, C-3 es equivalente a C-6, y C-4 es equivalente a C-5.

Además, los compuestos de éster de acridinio se divulgan en los documentos EP 1 43254 A1, US 5 521 13, WO 98/2421 A1, US 5 593 845 A, US 5 523 212 A, y US 6 783 948 B1. En la patente estadounidense No. 6,664,43 B2, Natrajan et al. divulgan derivados de NSP-DMAE con modificadores hidrofílicos adheridos al fenol. La estructura de un compuesto de ese tipo se ¡lustra en la figura de arriba. En este compuesto, se adhiere un residuo de diamino hexa(etilen) glicol (diamino-HEG) al fenol para incrementar la solubilidad acuosa del éster de acridinio. Un residuo de glutarato se adjunta al extremo de HEG y se convierte en el éster de NHS para habilitar el etiquetado de diversas moléculas.

Una clase diferente de compuestos de acridinio quimioluminiscentes estables ha sido descrita por Kinkel et al., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence vol. 4, pp. 136-139 (1989) y Mattingli, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence vol. 6, pp. 17-114 (1991) y la patente estadounidense No. 5,468,646. En esta clase de compuestos, la unión de éster fenólico se reemplaza por un residuo sulfonamlda, la cual Imparte estabilidad hidrolítica sin comprometer la producción de luz, según se ha reportado. En ésteres de acridinio, el fenol es el `grupo saliente mientras que en las sulfonamidas de acridinio la sulfonamlda es el `grupo saliente durante la reacción quimioluminiscente con peróxido alcalino.

La emisión de luz a partir de compuestos de acridinio es provocada normalmente por peróxido alcalino. La producción de luz total, la cual también puede denominarse rendimiento cuántico de quimioluminiscencla, es una combinación de las eficiencias de la reacción química que conduce a la formación de la acridona en estado excitado y al rendimiento cuántico de florescencia de esta última.

Un número de factores puede Incluir la producción total de luz de los compuestos de acridinio. Los rendimientos cuánticos de luminiscencia intrínseca de los compuestos de acridinio se ven afectados marcadamente por sus estructuras. Mientras que la mayoría de los estudios se han enfocado en el efecto del grupo saliente sobre la emisión de luz, ninguno ha tratado el efecto de los grupos funcionales sobre el anillo de acridinio o los rendimientos cuánticos de quimioluminiscencla aunque sus efectos sobre las longitudes de onda de la emisión de luz hayan sido bien documentados. Véase la patente estadounidense No. 6,355,83. Aunque la síntesis de un éster de acridinio con grupos metoxi en C-2 y C-7 del sistema de anillo de acridinio también haya sido divulgado en la patente estadounidense No. 5,521,13, el efecto de los dos grupos metoxi en el rendimiento cuántico o en la longitud de onda de la emisión de luz del éster de acridinio no se había divulgado.

Descripción de los dibujos

En los dibujos acompañantes:

Flg. 1(a) es una representación gráfica del ensayo de teofilina a altas concentraciones de teofilina;

Flg. 1 (b) es una representación gráfica del ensayo de teofilina a bajas concentraciones de teofilina;

La figura 2(a) es una representación gráfica del ensayo de la hormona estimulante de tiroides (TSH) a bajas concentraciones de TSH;

La figura 2(b) es una representación gráfica del ensayo de TSH a altas concentraciones de TSH.

Descripción de las modalidades preferidas

La presente invención se refiere al ¡nmunoensayo de la reivindicación 1 que usa compuestos de acridinio con rendimientos cuánticos incrementados. Se ha descubierto que colocar grupos donadores de electrones en el anillo de acridinio incrementa la cantidad de luz que se emite por el compuesto de acridinio correspondiente cuando se provoca quimioluminiscencia por peróxido alcalino. El concepto de grupos donantes de electrones es bien conocido por los profesionales en el campo. De manera típica, un grupo donador de electrones es un grupo funcional que es un átomo o una colección de átomos que, comparados con hidrógeno, donan electrones. Una discusión detallada sobre grupos donadores de electrones y que retiran electrones puede encontrarse en Smlth et al., Advanced Organic Chemistry: Reactlons, Mechanlsms y Structure (Química orgánica avanzada: reacciones, mecanismos estructura), pp. 16-17 (quinta edición Wlley-lntersclence).

Más específicamente, se ha encontrado que colocar uno o dos grupos funcionales donadores de electrones, tales como grupos metoxi o alcoxi, en C-2 y/o C-7 del anillo de acridinio de los compuestos de acridinio incrementa su rendimiento cuántico. La tabla 1 resume los incrementos cuánticos relativos de diversos compuestos de acridinio sustituidos con metoxi y alcoxi en relación con NSP-DMAE así como también sus máximos... [Seguir leyendo]

1. Un inmunoensayo heterogéneo mejorado para la detección o cuantificación de un analito usando un compuesto de acridinio hidrofílico, con alto rendimiento cuántico, que contiene grupos funcionales donadores de electrones en la posición C-2 y/o la posición C-7 del anillo de acridinio, donde el compuesto de acridinio con alto rendimiento cuántico tiene un rendimiento de luz cuántico relativo mayor que 1 al compararse con un compuesto de acridinio correspondiente sin grupos funcionales donantes de electrones en la posición C-2 y/o C-7 del anillo de acridinio, en cuyo caso el grupo funcional donantes de electrones se selecciona del grupo consistente en -OCH2CH2CH2SO3' y - (CH2CH2)n-CH2-CH2-OMe, donde n = -5.

2. El inmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 1, donde el compuesto de acridinio se selecciona del grupo consistente en ásteres de acridinio y sulfonamidas de acridinio.

3. Un inmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 1 para la cuantificación de un analito macromolecular que comprende:

a) proporcionar un conjugado de una molécula de enlazamiento específica para un analito macromolecular con el compuesto de acridinio hidrofílico, quimioluminiscente, con alto rendimiento cuántico, que contiene grupos funcionales donantes de electrones en la posición C-2 y/o C-7 del anillo de acridinio;

b) proporcionar una fase sólida inmovilizada con una segunda molécula específica para dicho analito macromolecular;

c) mezclar el conjugado, la fase sólida y una muestra que contiene el analito para formar un complejo de

enlazamiento;

d) separar el complejo de enlazamiento capturado sobre la fase sólida;

e) provocar la quimioluminiscencia del complejo de enlazamiento de d) adicionando reactivos que provocan quimioluminiscencia;

f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro; y

g) detectar la presencia o calcular la concentración del analito mediante comparación de la cantidad de luz emitida de la mezcla de reacción con una curva de respuesta de dosis estándar que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

4. El inmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 1 para la cuantificación de un analito de molécula pequeña que

comprende los siguientes pasos:

(a) proporcionar un conjugado de un analito con el compuesto de acridinio hidrofílico, quimioluminiscente, con alto rendimiento cuántico, que contienen grupos funcionales donantes de electrones en la posición C-2 y/o C-7 del anillo

de acridinio;

(b) proporcionar una fase sólida inmovilizada con una molécula de enlazamiento específica para el analito;

(c) mezclar el conjugado, la fase sólida y una muestra en la que supuestamente está contenido el analito para formar un complejo de enlazamiento;

(d) separar el complejo de enlazamiento capturado sobre la fase sólida;

(e) provocar la quimioluminiscencia del complejo de enlazamiento de d) mediante adición de reactivos que provocan quimioluminiscencia;

(f) medir la cantidad de luz con un luminómetro; y

(g) detectar la presencia o calcular la concentración del analito comparando la cantidad de luz emitida de la mezcla de reacción con una curva de respuesta de dosis estándar que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

5. El inmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 1 para la cuantificación de un analito de molécula pequeña que comprende los siguientes pasos:

(a) proporcionar una fase sólida inmovilizada con un analito o un análogo de analito;

(b) proporcionar un conjugado de una molécula de enlazamiento para el analito con el compuesto de acridinio hidrofílico, quimioluminiscente, con alto rendimiento cuántico, que contienen grupos funcionales donantes de electrones en la posición C-2 y/o C-7 del anillo de acridinio;

(c) mezclar la fase sólida, el conjugado y una muestra en la que supuestamente está contenido el analito para formar un complejo de enlazamiento;

(d) separar el complejo de enlazamiento capturado sobre la fase sólida;

(e) provocar la quimioluminiscencia del complejo de enlazamiento de d) mediante adición de reactivos que provocan quimioluminiscencia;

(f) medir la cantidad de luz con un luminómetro; y

(g) detectar la presencia o calcular la concentración del analito mediante comparación de la cantidad de luz emitida de la mezcla de reacción con una curva de respuesta de dosis estándar que relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

6. El inmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 1, donde el compuesto de acridinio hidrofílico, con alto rendimiento cuántico, tienen la siguiente estructura:

Ri es un alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos;

R2 y R3 son iguales o diferentes y son hidrógeno, haluros o R donde R es un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos en posiciones distintas de C(2) y C(7);

W1 y W2 son iguales o diferentes grupos funcionales donantes de electrones.

A' es un contraion que se introduce para emparejarse con el nitrógeno cuaternario de dicho núcleo de acridinio, y se selecciona del grupo consistente en CH3SO4", FS3", CF3SO4", C4F9SO4', CH3C6H4SO3', haluro, CF3COO", CH3HCOO-, y N3";

X es oxígeno o nitrógeno;

de modo que cuando X es oxígeno, se omite Z e Y se selecciona del grupo consistente en un residuo arilo sustituido de la fórmula:

A'

Z

donde

Y =

o Y=-N = C<R(1R|i)

donde R4 y Rs son hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR), o grupos -NR2 donde R en el nitrógeno pueden ser iguales o diferentes, R es un alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos, preferiblemente R4 y Rs son metilo, R4 y Rs pueden ser iguales o diferentes;

Rs y R7 son iguales o diferentes y son hidrógeno o igual es que R;

Re R9-R1,

donde no se requiere R9 y es alquilo ramificado o de cadena recta, arilo sustituido o no sustituido o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos, y

R1 es un grupo de salida o un grupo funcional electrofílico unido con un grupo de salida seleccionado del grupo consistente en:

XX^. xX^ AA

XK"'. XX ^ /

-SO2CI, -n3, -n2*ci*,

sA-'vO.

xX>" JCp'

un haluro o -COOH;

Rs y Re, y Rs y R7 son intercambiables;

R11 y R12 son iguales que Re definido arriba y pueden ser iguales o diferentes; y cuando X es nitrógeno Y es iqual

que Re definido arriba, Z es -S2-Y, e Y' es un grupo arilo sustituido o no sustituido o una cadena ramificada o recta.

7. El inmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 6, donde el compuesto de acridinio tienen la siguiente estructura:

so3' x*

Donde R13 es -OH, -O-N-succinimidilo, -NH-(CH2)5-C()--N-succinimidilo, NH-(C2H4)n-C2H4NH-C()-(CH2)3-C()- O-N-succinimidilo, donde n = a 5, o NH-R-NHR, R1 es un alquilo, alquenilo, alqulnilo o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos; A" es un contraion que se Introduce para emparejarse con el nitrógeno cuaternario de dicho núcleo 5 de acridinio, y se selecciona del grupo consistente en CH3SO4", FSO3", CF3SO4', C4F9SO4", CH3C6H4SO3", haluro, CF3COO', CH3COO', y N3" y X4 es un contraion cargado positivamente para emparejarse con el residuo de sulfonato y puede Incluir H+, Na+, K\ o NH4+.

8. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 6, donde el compuesto de acridinio tienen la siguiente estructura:

A'

9. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 6, donde el compuesto de acridinio tienen la siguiente estructura:

donde R13 es -OH, -O-N-succinimidilo, -NH-(CH2)5-C()--N-succinim¡d¡lo, -NH-(C2H4)n-C2H4NH-C()-(CH2)3- 15 C()--N-succinimidüo, donde n = a 5, o NH-R-NHR, , R-i es un alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos; A' es un contraion que se introduce para emparejarse con el nitrógeno cuaternario de dicho núcleo de acridinio, y se selecciona del grupo consistente en CH3SO4', FSO3', CF3SO4", C4F9SO4", CH3C6H4SO3", haluro, CF3COO_, CH3COO_, y N3', y n = a 5.

1. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 6, donde el compuesto de acridinio tienen la siguiente estructura:

donde R13 es -OH, -O-N-succinimidilo, -NH-(CH2)5-C()--N-succinimidilo, -NH-(C2H4)n-C2H4NH-C()-(CH2)3- 5 C()--N-succinimidiio donde n = a 5, o -NH-R-NHR, , R-i es un alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene hasta 2 heteroátomos; A' es un contraion que se introduce para emparejarse con el nitrógeno cuaternario de dicho núcleo de acridinio, y se selecciona del grupo consistente en CH3SO4', FSO3', CF3SO4', C4F9SO4', CH3C6H4SO3', haluro, CF3COO', CH3COO', y NO3', y n = a 5.

11. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 6, donde el compuesto de acridinio tienen la siguiente 1 estructura:

12. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 3, donde el anallto macromolecular se selecciona del grupo consistente en proteínas, ácidos nucleicos, oligosacáridos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, células, virus y polímeros sintéticos.

13. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 4, donde el anallto de molécula pequeña se selecciona del

grupo consistente en esteroides, vitaminas, hormonas, medicamentos terapéuticos y péptidos pequeños.

14. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 5, donde el anallto de molécula pequeña se selecciona del grupo consistente en esteroides, vitaminas, hormonas, medicamentos terapéuticos y péptidos pequeños.

15. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 3, donde el analito macromolecular es hormona estimulante 2 de tiroides.

16. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 4, donde el analito de molécula pequeña es teofilina.

17. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 2, donde el compuesto de acridinio es un éster de acridinio.

18. El ¡nmunoensayo heterogéneo de la reivindicación 2, donde el compuesto de acridinio es una sulfonamida de

acridinio.

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