Composición de células madre estromales derivadas de tejido adiposo autólogo y alogénico destinada al tratamiento de fístulas.

Método para la producción de una composición de células madre adiposas,

que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo, comprendiendo el método las etapas siguientes:

(a) aislar una fracción vascular estromal ('FVE') a partir del tejido adiposo recogido de un sujeto,

(b) incubar la FVE en un medio estromal,

(c) incubar la FVE en un medio de expansión que contiene EGF o bFGF como factor de crecimiento, con el fin de cultivar las células madre estromales derivadas de tejido adiposo, y

(d) cultivar las células madre estromales derivadas de tejido adiposo durante como mínimo un pase

Composición de células madre estromales derivadas de tejido adiposo autólogo y alogénico destinada al tratamiento de fístulas 5

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para la producción de células madre estromales derivadas de tejido adiposo humano en cantidades clínicamente eficaces con el fin de tratar fístulas, así como una composición producida por las mismas, en el que las células madre estromales pueden obtenerse de tejidos adiposos autólogos y 10 alogénicos.

Antecedentes de la técnica

La medicina regenerativa se refiere a un método para el tratamiento de tejidos y/o órganos con lesiones o una 15 función deteriorada, y se refiere de manera general a una terapia celular que utiliza células madre multipotentes. Las células madre derivadas de la médula ósea, uno de los tipos principales de células madre adultas utilizadas en la medicina regenerativa, pueden proliferar in vitro y diferenciarse en una diversidad de células, incluyendo, por ejemplo, miocitos, cardiocitos, osteocitos, condrocitos, adipocitos, células nerviosas, etc. Además, las células madre derivadas de la médula ósea presentan una actividad inmunomoduladora, pudiendo aplicarse de esta manera al 20 trasplante de médula ósea alogénica o utilizarse como agentes inmunosupresores para enfermedades autoinmunológicas.

Debido a que el tejido adiposo contiene además una gran cantidad de células madre, recientemente se han realizado estudios en profundidad sobre la utilización de células madre adiposas como material de trasplante. El 25 tejido adiposo presenta una cantidad considerablemente grande células madre en comparación con otros tipos de tejido (es decir, se aíslan aproximadamente 1.000 veces más células madre a partir de tejido adiposo que de la misma cantidad de médula ósea) y las células madre derivadas de tejido adiposo son multipotentes al igual que las células madre derivadas de la médula ósea, con capacidad de diferenciarse en condrocitos, osteocitos, adipocitos, miocitos y similares. Además, las células madre estromales derivadas del tejido adiposo muestran una expresión 30 similar de marcadores de superficie celular a la de las células madre derivadas de médula ósea y presentan actividades inmunomoduladoras in vivo e in vitro de la respuesta inmunológica autóloga o alogénica.

Las fístulas son canales generados anormalmente en el cuerpo y pueden generarse en diversos sitios del cuerpo por diferentes causas. Las fístulas de aparición más frecuente en general se encuentran presentes en el sistema 35 intestinal, incluyendo el ano y el recto. Las fístulas anales están causadas frecuentemente por un trastorno inflamatorio en el que se inflama la glándula anal, la inflamación se extiende al exterior de la piel y exuda una descarga tal como pus y explica aproximadamente 20% de los hemorroides anales.

La fístula anal se refiere sustancialmente a un canal anormal entre el canal rectal y una piel perianal, e induce una 40 descarga fecal anormal por un sitio abierto y no por el ano. Ello se debe con mayor frecuencia a la aparición de abscesos anorrectales, que, a su vez, forman fístulas que descargan pus. Dicha fístula formada se denomina 'fístula-en-ano'. Es decir, la fístula-en-ano es un orificio alargado formado a partir del recto o del interior del canal anal que se prolonga hasta una piel perianal al estallar el absceso anorrectal. La fístula-en-ano puede clasificarse en los cuatro tipos siguientes según la importancia de la función del esfínter anal externo en el funcionamiento anal: 45

(1) una fístula-en-ano de tipo inter-esfintérico que presenta un tracto de la fístula formado entre el esfínter anal interno y el esfínter anal externo, (2) una fístula-en-ano de tipo trans-esfintérico que presenta un tracto de la fístula formado que penetra a través del esfínter anal externo, 50

(3) una fístula-en-ano de tipo supra-esfintérico que presenta un tracto de la fístula formado en la parte superior del esfínter anal externo, (4) una fístula-en-ano de tipo extra-esfintérico que presenta una fístula primaria formada en una posición próxima al recto en la parte superior de una cripta anal y no en la cripta anal misma.

Es generalmente conocido que la causa principal de la fístula-en-ano es la infección de las glándulas perianales y, además, la fístula-en-ano en ocasiones se produce debido a tuberculosis, enfermedad de Crohn, cáncer, leucemia, leucopenia o similar. La enfermedad de Crohn se caracteriza por la inflamación crónica y recurrente del intestino y se considera una enfermedad rara. Entre las fístulas causadas por la enfermedad de Crohn pueden incluirse, por ejemplo, las fístulas recto-vaginales conectadas a la vagina; las fístulas entéricas formadas en una posición próxima 60 a los intestinos, etc., así como la fístula-en-ano.

La mayoría de fístulas se remedian mediante una operación quirúrgica. El objetivo principal del tratamiento de las fístulas en el recto perianal es tratar por completo la enfermedad, conservando simultáneamente la función normal de los esfínteres anales. Sin embargo, con frecuencia las fístulas son recurrentes, incluso tras una operación 65

quirúrgica, y pueden causar, por ejemplo, incontinencia fecal debido a trastornos de la función anal, etc. Por lo tanto, los métodos quirúrgicos actuales no proporcionan efectos del tratamiento satisfactorios.

Entre las operaciones de fístula pueden incluirse, por ejemplo, la fistulotomía, setón, utilización de colgajo desplazado, un procedimiento de relleno muscular, la utilización de cola de fibrina, o similares. Entre ellas, la cola de 5 fibrina ha sido utilizada como sellante quirúrgico en cirugía general mediante la mezcla de fibrinógeno y trombina para formar un coágulo de fibrina. Para la fístula-en-ano, se inyecta la cola de fibrina a través de una abertura externa en un tracto de fístula, de manera que se rellena el tracto de la fístula, así como una abertura interna de la fístula-en-ano.

En los últimos años, debido a que se llevan a cabo estudios en profundidad relacionados con las células madre, se ha llevado a cabo un método de tratamiento de la fístula-en-ano mediante el trasplante de células madre en un sitio de fístula. Por ejemplo, Mizuno et al. (Plast. Reconstr. Surg. 109:199-209, 2002) han demostrado que las células madre adultas aisladas a partir de tejido adiposo pueden diferenciarse en células musculares, mientras que Damian et al. (Dis Colon Rectum 48:1416-1423, 2005) han demostrado que las células madre adiposas pueden utilizarse con 15 seguridad para tratar fístulas-en-ano de pacientes que sufren de enfermedad de Crohn en ensayos clínicos de fase I. Además, se ha informado de que, al someter pacientes con enfermedad de Crohn a trasplante de células madre adultas para tratar una fístula rectal, no se produce incontinencia fecal ni siquiera transcurridos 3 meses del trasplante.

Es conocido que resulta sencillo implementar el cultivo in vitro de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Sin embargo, con el fin de obtener un número clínicamente eficaz de células, generalmente se requiere una cantidad relativamente grande de tejido adiposo y un periodo de cultivo prolongado. Concretamente, el tratamiento de fístulas en pacientes que sufren de enfermedades crónicas y/o recurrentes, tales como la enfermedad de Crohn, requiere una cantidad masiva de células, así como un procedimiento de cultivo celular mejorado. Además, en el 25 caso de que se autorice la utilización de células estromales derivadas de tejido adiposo alogénico, podrían resultar clínicamente muy útiles.

El documento nº WO 2006/136244 (28 de diciembre de 2006) da a conocer el tratamiento de las fístulas con células madre estromales derivadas de tejido adiposo y el uso de las mismas. Sin embargo, debido a que las células madre 30 adiposas utilizadas en el tratamiento se obtienen del paciente mismo, en el caso de que éste no presente suficiente tejido adiposo, el número de células madre contenidas en el tejido adiposo sea considerablemente reducido, o no se consiga cultivar células madre autólogas, podría no conseguirse un tratamiento clínicamente adecuado. Especialmente en el caso de pacientes con fístula de Crohn, se observa una inflamación entérica significativa, que induce pérdida de peso y un bajo índice de masa corporal del paciente. Para este tipo de pacientes, resulta difícil 35 garantizar una cantidad suficiente de células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Además, debido a que la enfermedad continúa durante un periodo de tiempo prolongada y empeora habitualmente provocando la aparición de varias fístulas en el mismo paciente y se... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de una composición de células madre adiposas, que comprende células madre estromales derivadas de tejido adiposo, comprendiendo el método las etapas siguientes:

(a) aislar una fracción vascular estromal ('FVE') a partir del tejido adiposo recogido de un sujeto, (b) incubar la FVE en un medio estromal, (c) incubar la FVE en un medio de expansión que contiene EGF o bFGF como factor de crecimiento, con el fin de cultivar las células madre estromales derivadas de tejido adiposo, y (d) cultivar las células madre estromales derivadas de tejido adiposo durante como mínimo un pase. 10

2. Método según la reivindicación 1, en el que el medio de expansión del procedimiento (c) comprende EGF o bFGF en una concentración de entre 0, 1 y 100 ng/ml.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el medio de expansión comprende EGF o bFGF en una 15 concentración de entre 1 y 10 ng/ml.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el tejido adiposo se recoge de un sujeto alogénico.