Colección de anticuerpos sintéticos para tratar enfermedades.

Una colección de anticuerpos sintéticos o de fragmentos funcionales de los mismos,

que comprende regiones estructurales de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable,

en donde dichas regiones estructurales de la cadena pesada variable y dichas regiones estructurales de la cadena ligera variable comprenden secuencias de proteínas de la línea germinal de una pareja de proteínas de la línea germinal, en donde dicha pareja de proteínas de la línea germinal comprende las siguientes propiedades:

i) una tasa de presentación relativa en formato Fab que comprende un valor dentro del 75% superior de los Fabs sometidos a ensayo;

ii) un nivel de expresión en formato Fab de al menos 0,4 en comparación con Fab VH1-69 VLA_VI1-40 AYA cuyas secuencias se describen en la Tabla 5, la Tabla 9, la Figura 45A y la Figura 47A;

iii) una estabilidad térmica a 60ºC o más durante al menos 45 minutos en formato Fab;

iv) una estabilidad en suero bovino o de ratón en formato Fab durante más de diez días a 37ºC;

v) un nivel de expresión en formato IgG de al menos 0,4 en comparación con MOR03080 cuyas secuencias de CDR se describen en la Tabla 31; y

vi) una estabilidad en suero en formato IgG durante catorce días a 37ºC;

en donde dicha colección de anticuerpos o de fragmentos funcionales de los mismos comprende secuencias de proteínas de la línea germinal de al menos dos parejas de proteínas diferentes de la línea germinal,

en donde dicha pareja de proteínas de la línea germinal está codificada por una pareja de genes de la línea germinal, en donde las parejas de proteínas de la línea germinal se seleccionan a partir de IGHV1-18/IGKV1-05; IGHV1-18 /IGLV2-23; IGHV1-46/IGKV1-09; IGHV1-46/IGKV1-39; IGHV1-46 /IGKV3-15; IGHV1-69*01/IGKV1-05; IGHV3- 07/IGKV1-09; IGHV3-07/IGKV1-12; IGHV3-07/IGKV1-27; IGHV3-07/IGKV3-15; IGHV3-07 /IGLV1-47; IGHV3-07 25 /IGLV2-23; IGHV3-07 /IGLV3-01; IGHV3-11/IGKV1-05; IGHV3-11/IGKV1-06; IGHV3-11/IGKV1-12; IGHV3-11 /IGKV1-16; IGHV3-11/IGKV3-15; IGHV3-11/IGLV1-47; IGHV3-11/IGLV2-23; IGHV3-15/IGKV1-05; IGHV3-15/IGKV1- 06; IGHV3-15/IGKV1-09; IGHV3-15/IGKV1-12; IGHV3-15/IGKV1-16; IGHV3-15/IGKV1-27; IGHV3-15/IGKV1-39; IGHV3-15/IGKV3-15; IGHV3-15/IGLV1-40; IGHV3-15/IGLV1-51; IGHV3-15/IGLV2-11; IGHV3-21/IGKV1-06; IGHV3- 21/IGKV1-12; IGHV3-21/IGKV1-27; IGHV3-21/IGKV1-39; IGHV3-21/IGLV2-14; IGHV3-21/IGLV2-23; IGHV3- 30/IGLV2-23; IGHV3-30/IGLV3-1; IGHV3-33/IGKV3-15; IGHV3-33/IGLV2-23; IGHV3-48/IGKV1-27; IGHV3- 53/IGKV1-09; IGHV3-53/IGKV1-12; IGHV3-53/IGLV1-51; IGHV3-53/IGLV2-23; IGHV3-53/IGLV3-1; IGHV3- 74/IGKV1-06; IGHV3-74/IGKV1-09; IGHV3-74/IGKV1-27; IGHV3-74/IGKV3-15; IGHV3-74/IGLV1-51; IGHV4- 04/IGLV2-23; IGHV4-04/IGLV3-1; IGHV4-04/IGLV3-21; IGHV4-39/IGLV2-14; IGHV4-39/IGLV3-1; IGHV5-51/IGKV1- 09; IGHV5-51/IGLV2-23; IGHV5-51/IGLV3-1; IGHV6-1/IGKV1-06; y IGHV6-1/IGLV2-23, cuyas secuencias se descri35 ben en las Figuras 45 A-C, las Figuras 46 A-C y las Figuras 47 A-B.

Colección de anticuerpos sintéticos para tratar enfermedades ANTECEDENTES

Los avances en el desarrollo farmacéutico, especialmente en el campo de los anticuerpos terapéuticos, están permitiendo y/o mejorando rápidamente el tratamiento de muchas enfermedades. Estos avances con los que se alcanzan nuevas áreas como meta y proporcionan nuevos mecanismos de acción, están mejorando cada vez más la calidad de vida de pacientes, incluso con las enfermedades más graves y problemáticas. Uno de los retos del sistema de atención sanitaria en general y de los pacientes en particular, es que los costes de nuevos fármacos, facilitados por estos avances farmacéuticos, también se incrementan rápidamente. Los costes elevados son el resultado de las inversiones necesarias para el desarrollo de productos farmacéuticos, especialmente de anticuerpos, que actualmente superan los mil millones de dólares por producto comercializado. El alto riesgo de fracaso en el desarrollo y los plazos de desarrollo muy largos hacen que estas inversiones sean inevitables. Puede durar más de quince años desde el momento de la identificación de un anticuerpo terapéutico potencial hasta que llega al mercado y puede beneficiar a los pacientes. Cada etapa del desarrollo, desde la identificación, la preclínica, la clínica hasta su introducción en el mercado, está plagada de desafíos y riesgos. Las compañías farmacéuticas están haciendo cálculos constantemente para determinar cómo reducir los costes del desarrollo mediante la reducción de plazos y los riesgos de fracaso, con el fin de obtener los medicamentos más eficaces para ponerlos a disposición de pacientes de forma rápida y con el fin de que sean asequibles.

La siguiente descripción proporciona un avance considerable que permite una identificación más rápida de los anticuerpos terapéuticos óptimos para el tratamiento de posiblemente cualquier enfermedad. Los candidatos para anticuerpos terapéuticos deben cumplir una serie de criterios de desarrollo con el fin de llegar al mercado, como por ejemplo, una estabilidad a largo plazo y rendimientos elevados de expresión. El avance descrito incrementa la probabilidad y la velocidad para identificar un anticuerpo que puede cumplir con todos los criterios de desarrollo rigurosos, exactamente desde el principio. El anticuerpo resultante será menos costoso de producir y será eficaz y seguro en el tratamiento de numerosas enfermedades.

Un método bien conocido para la identificación de anticuerpos terapéuticos es a través del uso de tecnología de presentación en fagos. La presentación en fagos utiliza partículas similares a virus que se cultivan en bacterias para presentar anticuerpos. Un resumen de los respectivos vectores de presentación en fagos se proporciona en Scott J K, et al: "Phage display: A laboratory manual", Coid Spring Harbor Laboratory Press (21). Una ventaja de esta tecnología es que las genotecas utilizadas son enormes, con un máximo de 1 X 11 anticuerpos, que se pueden someter a ensayo rápidamente para estudiar la unión a cualquier diana relevante para cualquier enfermedad. Véase, por ejemplo, Knappik et al., (2), "Fully synthetic human combinatoria! antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides", J. Mol. Biol. 11; 296(1 ):57-86. El beneficio de trabajar con una cantidad tan grande es que el resultado de un escrutinio en busca de una diana puede dar como resultado cientos de anticuerpos que se unen a la diana terapéutica, pudiendo ser todos ellos terapéuticamente relevantes. Un problema, sin embargo, es que frecuentemente solo unos pocos de estos anticuerpos se pueden desarrollar, es decir, que pueden satisfacer todos los criterios rigurosos requeridos con el fin de que lleguen al mercado.

Para que una nueva genoteca de presentación en fagos disminuya rápidamente los plazos de identificación y reduzca los riesgos inherentes, la genoteca debería comprender anticuerpos con propiedades que son necesarias para la selección y el desarrollo clínico y que darán como resultado un tratamiento seguro y eficaz en los pacientes. Tales propiedades incluyen: 1) tasas de presentación en fagos elevadas, de modo que todos y cada uno de los anticuerpos de la colección se pueden someter a ensayo frente a la diana de interés; 2) niveles de expresión elevados, de manera que el anticuerpo o un fragmento se pueden reproducir de manera eficaz; 3) estabilidad térmica elevada, de modo que el anticuerpo puede llegar a los pacientes en una forma efectiva; 4) estabilidad en suero elevada, de manera que el anticuerpo puede sobrevivir en el cuerpo durante un periodo de tiempo terapéuticamente relevante; 5) riesgo de inmunogenicidad reducido, lo que aumenta la seguridad y 5) diversidad elevada, de manera que una geno- teca se puede utilizar para identificar anticuerpos contra cualquier diana terapéutica.

Una genoteca, que de manera esencial imita el sistema inmune humano, debería ser muy valiosa, o incluso la solución óptima. El sistema inmune humano está compuesto de anticuerpos codificados por genes de la línea germinal. Los anticuerpos comprenden, en parte, una cadena pesada variable y cadenas ligeras variables. Hay aproximadamente 5 genes de la línea germinal de la cadena pesada variable y aproximadamente 5 genes de la línea germinal de la cadena ligera variable, proporcionando de forma combinada aproximadamente 25 combinaciones de parejas diferentes de cadena pesada y ligera variable. En los seres humanos, se cree que se producen las 25 combinaciones. Sin embargo, se ha descubierto, que ciertas cadenas pesadas variables, ciertas cadenas ligeras variables y/o combinaciones (parejas) de cadenas pesada y ligera variables, se expresan a un nivel más elevado que otras. Se planteó la hipótesis de que debe haber alguna razón por la que algunas se expresan más que otras y, si es así, que los genes de la línea germinal altamente expresados pueden tener propiedades funcionales favorables. Por lo tanto, una forma de proporcionar una genoteca de anticuerpos que tienen propiedades funcionales favorables, es generar una genoteca que comprende la cadena pesada variable, la cadena ligera variable y/o las parejas de la línea germinal de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable abundantes procedentes del repertorio in

muñe humano.

Además, se cree que las secuencias de genes de la línea germinal presentes en los seres humanos tienen una in- munogenicidad muy baja, por razones obvias, por lo tanto estas secuencias se pueden imitar en anticuerpos recombinantes con el fin de reducir el riesgo de inmunogenicidad.

Se han iniciado metodologías para evaluar los emparejamientos de genes de la línea germinal de la cadena pesada y ligera variable, prevalentes en el repertorio inmune humano. Véase, de Wildt et al., Analysis of heavy and light chain pairings indicates that receptor editing shapes the human antibody repertoire, J Mol Biol. 22;285(3):895-91 (enero de 1999), que se incorpora como referencia en su totalidad. Wildt et al. tomaron muestras de sangre procedentes de donantes humanos, clasificaron los linfocitos B lgG+ que se habían sometido a hipermutación somática, amplificaron mediante PCR los ADNc, secuenciaron cada ADNc y alinearon cada secuencia con los genes conocidos de la línea germinal del dominio variable humano. Wildt et al. observaron que solo unos pocos genes de la línea germinal dominaban el repertorio inmune y que los segmentos de genes de la cadena pesada y ligera expresados frecuentemente, se emparejan con frecuencia.

En el documento JP2619793 se identifican anticuerpos codificados por ciertos genes de la línea germinal, en donde dichos anticuerpos tienen actividad enzimática.

También se han llevado a cabo intentos de conservar los emparejamientos del dominio variable de la cadena pesada y ligera de linfocitos B individuales. Por ejemplo, se han descrito genotecas de "parejas de cognados" del dominio variable. Véase Meijer et al., Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing, J Mol Biol., 358(3):764-72 (5 de mayo de 26); y el documento W2542774. Se han generado genotecas de acuerdo con las técnicas descritas en Meijer et al. a partir de linfocitos B individuales procedentes de un hospedador inmunizado. Generalmente, los linfocitos B se clasifican, por FACS, de modo que se seleccionan linfocitos B CD38hi, que representan células hipermutadas somáticamente, sus ADNc se amplifican mediante PCR y los productos génicos de los anticuerpos se insertan en vectores Fab para una selección. Tales genotecas de parejas de cognados no están exentas de limitaciones. Por ejemplo, los hospedadores que proporcionan los linfocitos B normalmente están inmunizados; y las poblaciones de linfocitos... [Seguir leyendo]

1. Una colección de anticuerpos sintéticos o de fragmentos funcionales de los mismos, que comprende regiones estructurales de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable,

en donde dichas regiones estructurales de la cadena pesada variable y dichas regiones estructurales de la cadena ligera variable comprenden secuencias de proteínas de la línea germinal de una pareja de proteínas de la línea germinal,

en donde dicha pareja de proteínas de la línea germinal comprende las siguientes propiedades:

i) una tasa de presentación relativa en formato Fab que comprende un valor dentro del 75% superior de los Fabs sometidos a ensayo;

ii) un nivel de expresión en formato Fab de al menos ,4 en comparación con Fab VH1-69 VLA_VI1-4 AYA cuyas secuencias se describen en la Tabla 5, la Tabla 9, la Figura 45A y la Figura 47A;

iii) una estabilidad térmica a 62C o más durante al menos 45 minutos en formato Fab;

iv) una estabilidad en suero bovino o de ratón en formato Fab durante más de diez días a 372C;

v) un nivel de expresión en formato IgG de al menos ,4 en comparación con MOR38 cuyas secuencias de CDR se describen en la Tabla 31;

vi) una estabilidad en suero en formato IgG durante catorce días a 372C;

en donde dicha colección de anticuerpos o de fragmentos funcionales de los mismos comprende secuencias de proteínas de la línea germinal de al menos dos parejas de proteínas diferentes de la línea germinal,

en donde dicha pareja de proteínas de la línea germinal está codificada por una pareja de genes de la línea germinal,

en donde las parejas de proteínas de la línea germinal se seleccionan a partir de IGHV1-18/IGKV1-5; IGHV1-18 /IGLV2-23; IGHV1-46/IGKV1-9; IGHV1-46/IGKV1-39; IGHV1-46 /IGKV3-15; IGHV1-69*1/IGKV1-5; IGHV3- 7/IGKV1-9; IGHV3-7/IGKV1-12; IGHV3-7/IGKV1-27; IGHV3-7/IGKV3-15; IGHV3-7 /IGLV1-47; IGHV3-7 /IGLV2-23; IGHV3-7 /IGLV3-1; IGHV3-11/IGKV1-5; IGHV3-11/IGKV1-6; IGHV3-11/IGKV1-12; IGHV3-11 /IGKV1-16; IGHV3-11/IGKV3-15; IGHV3-11/IGLV1 -47; IGHV3-11/IGLV2-23; IGHV3-15/IGKV1-5; IGHV3-15/IGKV1- 6; IGHV3-15/IGKV1 -9; IGHV3-15/IGKV1-12; IGHV3-15/IGKV1-16; IGHV3-15/IGKV1-27; IGHV3-15/IGKV1-39; IGHV3-15/IGKV3-15; IGHV3-15/IGLV1-4; IGHV3-15/IGLV1-51; IGHV3-15/IGLV2-11; IGHV3-21/IGKV1-6; IGHV3- 21/IGKV1 -12; IGHV3-21/IGKV1-27; IGHV3-21/IGKV1-39; IGHV3-21/IGLV2-14; IGHV3-21/IGLV2-23; IGHV3-

3/IGLV2-23; IGHV3-3/IGLV3-1; IGHV3-33/IGKV3-15; IGHV3-33/IGLV2-23; IGHV3-48/IGKV1-27; IGHV3-

53/IGKV1-9; IGHV3-53/IGKV1-12; IGHV3-53/IGLV1-51; IGHV3-53/IGLV2-23; IGHV3-53/IGLV3-1; IGHV3-

74/IGKV1-6; IGHV3-74/IGKV1-9; IGHV3-74/IGKV1-27; IGHV3-74/IGKV3-15; IGHV3-74/IGLV1-51; IGHV4-

4/IGLV2-23; IGHV4-4/IGLV3-1; IGHV4-4/IGLV3-21; IGHV4-39/IGLV2-14; IGHV4-39/IGLV3-1; IGHV5-51/IGKV1- 9; IGHV5-51/IGLV2-23; IGHV5-51/IGLV3-1; IGHV6-1/IGKV1-6; y IGHV6-1/IGLV2-23, cuyas secuencias se describen en las Figuras 45 A-C, las Figuras 46 A-C y las Figuras 47 A-B.

2. Una colección según la reivindicación 1, en la que dichas regiones estructurales de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable consisten esencialmente en secuencias de proteínas de la línea germinal de las parejas de proteínas de la línea germinal que comprenden las siguientes propiedades:

I) una tasa de presentación relativa en formato Fab que comprende un valor dentro del 75% superior de los Fabs sometidos a ensayo;

II) un nivel de expresión en formato Fab de al menos ,4 en comparación con Fab VH1-69 VLA_VI1-4 AYA, cuyas secuencias se describen en la Tabla 5, la Tabla 9, la Figura 45A y la Figura 47A;

III) una estabilidad térmica a 62C o más durante al menos 45 minutos en formato Fab;

IV) una estabilidad en suero bovino o de ratón en formato Fab durante más de diez días a 372C;

V) un nivel de expresión en formato IgG de al menos ,4 en comparación con MOR38, cuyas secuencias de CDR se describen en la Tabla 31;

VI) una estabilidad en suero bovino en formato IgG durante catorce días a 372C.

3. Una colección según las reivindicaciones 1 o 2, en la que dichas regiones estructurales de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable consisten en secuencias de proteínas de la línea germinal de las parejas de proteínas de la línea germinal que comprenden las siguientes propiedades:

i) una tasa de presentación relativa en formato Fab que comprende un valor dentro del 75% superior de los Fabs sometidos a ensayo;

ii) un nivel de expresión en formato Fab de al menos ,4 en comparación con Fab VH1-69 VLA_VI1-4 AYA, cuyas secuencias se describen en la Tabla 5, la Tabla 9, la Figura 45A y la Figura 47A;

iii) una estabilidad térmica a 62C o más durante al menos 45 minutos en formato Fab;

iv) una estabilidad en suero bovino o de ratón en formato Fab durante más de diez días a 372C;

v) un nivel de expresión en formato IgG de al menos ,4 en comparación con MOR38 cuyas secuencias de CDR se describen en la Tabla 31;

y

vi) una estabilidad en suero bovino en formato IgG durante catorce días a 372C.

4. Una colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichas parejas de genes de la línea germinal están presentes a una concentración de al menos ,5% en el repertorio inmune humano.

5. Una colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichas parejas de genes de la línea germinal están presentes a una concentración de al menos ,7% en el repertorio inmune humano no activado.

6. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprenden secuencias humanas.

7. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha colección de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprende secuencias de proteínas de la línea germinal de al menos diecisiete parejas de proteínas diferentes de la línea germinal.

8. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprenden una o varias regiones determinantes de complementariedad que comprenden secuencias de proteínas de la línea germinal.

9. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprenden regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2 y FR3 que comprenden secuencias de proteínas de la línea germinal.

1. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprenden una región FR4 seleccionada a partir del grupo que consiste en: JH4, Jk1 y JA2/3.

11. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprenden una región HCDR3 diversificada.

12. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos comprenden una región LCDR3 diversificada.

13. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la colección comprende 1 X 14 anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos.

14. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichas parejas de proteínas de la línea germinal comprenden una tasa de presentación relativa en formato Fab que comprende un valor dentro del 6% superior de los Fabs sometidos a ensayo.

15. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichas parejas de proteínas de la línea germinal comprenden un nivel de expresión en formato Fab de al menos ,6 en comparación con Fab VH1-69 VLA_VI1-4 AYA, cuyas secuencias se describen en la Tabla 5, la Tabla 9, la Figura 45A y la Figura 47A.

16. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dichas parejas de proteínas de la línea germinal comprenden un nivel de expresión en formato IgG de al menos ,6 en comparación con MOR38.

17. La colección según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos fragmentos funcionales de dichos anticuerpos se seleccionan a partir del grupo que consiste en Fab, F(ab')2, Fab', Fv y scFv.

18. Una colección de ácidos nucleicos que codifican la colección según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

19. Una colección de vectores que comprende los ácidos nucleicos según la reivindicación 18.

2. Una colección de células hospedadoras recombinantes que comprende los ácidos nucleicos según la reivindicación 18 o los vectores según la reivindicación 19.

21. Las células hospedadoras recombinantes según la reivindicación 2, que son procariotas o eucariotas.

22. Las células hospedadoras recombinantes según la reivindicación 21, que son E. colio de mamífero.

23. Un método para producir la colección de anticuerpos sintéticos o fragmentos funcionales de los mismos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3.

24. Un método según la reivindicación 23, en el que la etapa de producción comprende además las etapas de

a) obtener datos que comprenden las parejas de genes de la línea germinal de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable presentes en el repertorio inmune humano;

b) identificar las parejas de proteínas de la línea germinal de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable que comprenden las siguientes propiedades:

i) una tasa de presentación relativa en formato Fab que comprende un valor dentro del 75% superior de los Fabs sometidos a ensayo;

ii) un nivel de expresión en formato Fab de al menos ,4 en comparación con Fab VH1-69 VLA_VI1-4 AYA, cuyas secuencias se describen en la Tabla 5, la Tabla 9, la Figura 45A y la Figura 47A;

iii) una estabilidad térmica a 62C o más durante al menos 45 minutos en formato Fab;

iv) una estabilidad en suero bovino o de ratón en formato Fab durante más de diez días a 372C;

v) un nivel de expresión en formato IgG de al menos ,4 en comparación con MOR38, cuyas secuencias de CDR se describen en la Tabla 31;

y

vi) una estabilidad en suero bovino en formato IgG durante catorce días a 372C; y

c) generar una colección de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que comprende las secuencias de proteínas de la línea germinal de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable de las parejas de proteínas de la línea germinal identificadas en la etapa b).

25. Un método según la reivindicación 24, en el que la etapa b) comprende además las etapas de

ba) identificar las parejas de genes de la línea germinal de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable presentes en una concentración de al menos ,5% en el repertorio inmune humano;

bb) generar anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que comprenden las parejas de proteínas de la línea germinal identificadas en la etapa ba); y

be) evaluar las siguientes propiedades de dichas parejas de proteínas de la línea germinal:

i) tasa de presentación relativa en formato Fab;

ii) nivel de expresión en formato Fab;

iii) estabilidad térmica a 62C o más en formato Fab;

iv) estabilidad en suero bovino o de ratón en formato Fab durante más de diez días a 372C;

v) nivel de expresión en formato IgG; y

vi) estabilidad en suero bovino en formato IgG durante catorce días a 372C.