Cepa del virus de la fiebre amarilla de alto rendimiento con mayor propagación en células.

Una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la envuelta,

en la que la molécula de ácido nucleico de dicha cepa comprende una mutación en el codón para el aminoácido en la posición 160, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el minoácido en la posición 160 de la proteína de la envuelta produce un cambio de codón de lisina a arginina

Cepa del virus de la fiebre amarilla de alto rendimiento con mayor propagación en células Antecedentes de la invención

El virus de la fiebre amarilla es endémico, es decir, está presente continuamente con bajos niveles de infección en algunas áreas tropicales de África y las Américas, en donde cada cierto tiempo se expande para formar epidemias. Otras partes del mundo, que incluyen las regiones costeras de Sudamerica, las islas del Caribe, y America del Norte y Central, están infestadas por el mosquito vector capaz de transmitir el virus y, por tanto, se considera que están en riesgo de padecer epidemias de fiebre amarilla (World Health Organization Fact Sheet No. 1, revisado diciembre, 21).

Por ejemplo, solo en África, están es riesgo treinta y tres países con una población reunida de 58 millones de personas (Id.). Cada año, la Organización Mundial de la Salud (OMS) calcula que se producen 2. casos se fiebre amarilla, con 3. muertes (Id.). También se cree que los viajes a estas regiones tropicales originan un pequeño número de casos importados en países en general libres de la fiebre amarilla. Aunque no se han indicado casos de fiebre amarilla en Asia, "esta región está en riesgo, porque están presentes los primates y los mosquitos apropiados" (Id.).

El virus de la fiebre amarilla (YF, "Yellow Fever") pertenece al género Flavivirus, de la familia Flaviviridae. En el denominado "ciclo selvático" o "de la jungla", el virus YF es enzoótico, mantenido y transmitido por mosquitos que se reproducen en el dosel a los monos en la selva. El "ciclo urbano" comienza cuando los seres humanos se infectan cuando entran en la selva y son picados por mosquitos infectados por YF. El "ciclo urbano" continúa con la transmisión peridoméstica desde los seres humanos a los mosquitos y, por tanto, a otros seres humanos, y puede provocar una epidemia de fiebre amarilla en pueblos y ciudades. La enfermedad varía en gravedad desde una enfermedad febril autolimitada a una hepatitis grave y enfermedad hemorrágica mortal.

Los seres humanos no vacunados, que incluyen los nativos y los que viajan a áreas endémicas de YF, están en riesgo significativo de infección por YF cuando sus actividades laborales y otro tipo de actividades les ponen en contacto con mosquitos infectados en el ciclo selvático o el ciclo urbano.

Los pacientes con fiebre amarilla pueden ser virémicos, es decir, tener el virus en la sangre, durante 3 a 6 días durante la fase temprana de la enfermedad. A esta fase le puede seguir un corto periodo de remisión de los

síntomas.

La fase tóxica se desarrolla a medida que vuelve la fiebre, con unos síntomas clínicos que incluyen, por ejemplo, fiebre alta y náuseas, síntomas hemorrágicos, que incluyen hematemesis (vómito negro), epistaxis (sangrado de la nariz), sangrado de las encías, y hemorragias petequiales y purpúricas (hematomas). En los casos graves a menudo se produce un mayor ictericia y proteinuria.

En los estadios tardíos de la enfermedad, los pacientes pueden desarrollar hipotensión, choque, acidosis metabólica, necrosis tubular aguda, disfunción miocárdica, y arritmia cardíaca. También puede producirse confusión, ataques y coma, así como complicaciones, tales como infecciones bacterianas secundarias e insuficiencia renal.

No existe un tratamiento específico para la fiebre amarilla. Los pasos para evitar la fiebre amarilla incluyen el uso de repelentes de insectos, ropa protectora, y vacunación con la vacuna atenuada que está disponible, aunque presenta riesgos.

El documento US27/269458 A1 describe un virus de la fiebre amarilla recombinante que tiene una mutación en uno o más aminoácidos de la región bisagra en la proteína E en las posiciones 48-61, 127-131, 196-283. El objetivo de este documento es proporcionar mejores rendimientos para fabricar vacunas.

Están disponibles vacunas vivas atenuadas producidas a partir de la subcepa 17D, pero ciertos acontecimientos adversos asociados con la vacuna atenuada pueden conducir a una grave infección con el virus 17D vivo y a acontecimientos neurotrópicos y viscerotrópicos graves y mortales, pareciéndose estos últimos a la infección grave por el virus YF de tipo salvaje. Por tanto, es necesaria una vacuna no replicante, inactivada y más segura que suscite una respuesta de anticuerpos neutralizantes, a la par que elimine el potencial para la aparición de aconticimientos neurotrópicos y viscerotrópicos adversos.

Por tanto, existe una necesidad no cubierta de una vacuna no replicante o "muerta", inactivada y eficaz para evitar el potencial para la aparición de los acontecimientos neurotrópicos y viscerotrópicos adversos asociados con la vacuna de YF 17D atenuada disponible en la actualidad. Además, es necesaria una vacuna mejorada producida en células Vero sin proteínas derivadas de animales, una vacuna que pueda ser utilizada con seguridad por personas para las cuales la vacuna viva está contraindicada, o para las cuales aparecen advertencias en la etiqueta. Estos individuos incluyen personas inmunodeprimidas, personas con enfermedad tímica, personas alérgicas al huevo, niños pequeños y ancianos.

Un problema con cualquier virus potencialmente inactivado es que necesita administrarse a una titulación mayor que las vacunas atenuadas vivas existentes, puesto que estas últimas pueden expandir la masa antigénica durante los ciclos de replicación en el hospedante, mientras que una vacuna inactivada contiene una dosis fija de antígeno. Por tanto, para desarrollar una vacuna inactivada suficientemente potente resulta deseable modificar el virus YF para producir un alto rendimiento del virus en el fluido sobrenadante de un cultivo celular. Resulta muy deseable emplear la cepa de la vacuna 17D atenuada para la fabricación de vacunas, puesto que la cepa 17D puede ser manipulada a un nivel de biocontención más bajo que el virus YF virulento de tipo salvaje, y la vacuna resultante sería más segura en el caso en que algunos virus vivos residuales estuviesen presentes en el producto final. Sin embargo, los rendimientos de la cepa de la vacuna 17D atenuada en cultivo celular son inherentemente menores que los rendimientos del virus de tipo salvaje. Por estas razones, serían útiles modificaciones de la cepa de la vacuna 17D para lograr mayores rendimientos en el cultivo celular empleado para la producción de vacunas.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona una vacuna que comprende una cepa o cepas del virus de la fiebre amarilla que se han adaptado para propagarse en células Vero con rendimientos mayores que un virus inadaptado. Un "virus inadaptado" significa la vacuna del virus de la fiebre amarilla conocida como 17D. El análisis de la secuencia de ejemplos de este virus demuestra que un virus adaptado que posee una mutación en la proteína de la envuelta (E) que provoca una sustitución de lisina a arginina en el resto aminoácido 16 tiene propiedades mejoradas. La invención proporciona vacunas que comprenden un virus de la fiebre amarilla que contiene una o más mutaciones en la proteína E, que dan como resultado una mayor propagación en células Vero y unos rendimientos mayores que un virus inadaptado.

El virus de la fiebre amarilla es la especie prototípica del género Flavivirus, de la familia Flaviviridae. Los estudios estructurales y funcionales de la proteína E del virus de la encefalitis portado por garrapatas (TBE), un miembro virulento de crecimiento rápido del género Flavivirus, indican que los dominios I y II de la proteína E de TBE participan en un cambio conformacional dependiente de pH ácido que facilita la fusión de membrana del flavivirus con el hospedante y la posterior infectividad. El punto de unión de los dominios I y II actúa como "bisagra molecular" que provoca una importante redisposición de estos dominios desde la estructura dimérica normal de la proteína E a pH ácido a un estado homotrimérico. Rey, F.A. et al., The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution, Nature, 375:291-298 (1995); Heinz, F.X. et al., Structural changes and functional control of the tick- borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM, Virology, 198:19-117 (1994); Mandl, C.W. et al., Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick- borne encephalitis virus as a model, Journal of Virology, 63(2):564- 571 (1989); Harrison, S.C., Viral membrane fusión, Nature structural and molecular biology, 15(7):69-698 (28); Stiasny, K. et al., Molecular mechanisms of flavivirus membrane fusión, Amino acids, DOI 1.17/s726-9-37-4, publicado en línea el 1 de noviembre de 29.

La Lys 16 en la proteína E del virus de la fiebre amarilla está... [Seguir leyendo]

1.- Una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la envuelta, en la que la molécula de ácido nucleico de dicha cepa comprende una mutación en el codón para el aminoácido en la posición 16, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el aminoácido en la posición 16 de la proteína de la envuelta produce un cambio de codón de Usina a arginina.

2.- La cepa del virus de la fiebre amarilla modificado según la reivindicación 1, en la que el virus de la fiebre amarilla modificado se inactiva con beta-propiolactona.

3.- Una vacuna que comprende una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado inactivado según la reivindicación 2, que comprende además opcionalmente un adyuvante, en la que el adyuvante es preferiblemente hidróxido de aluminio.

4.- Una composición que comprende la vacuna según la reivindicación 3 o el virus de la fiebre amarilla según la reivindicación 1, para su uso para inducir una respuesta inmunológica contra el virus de la fiebre amarilla en un sujeto.

- Una composición para su uso según la reivindicación 4, en la que el sujeto está en riesgo de desarrollar, pero aún no padece, una infección por el virus de la fiebre amarilla.

6 - Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende una secuencia que codifica una proteína de la envuelta del virus de la fiebre amarilla según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una mutación de nucleótidos en el codón para el aminoácido en la posición 16 de la proteína de la envuelta, en la que la mutación del ácido nucleico en el codón para el aminoácido en la posición 16 de la proteína de la envuelta preferiblemente produce un cambio de AAG a AGG, AGA, CGC, CGA, CGG o CGU.

7.- Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, que comprende un secuencia que codifica una proteína de la envuelta modificada del virus de la fiebre amarilla, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de proteína de SEQ ID NO:4 o 6.

8 - Un método para fabricar una vacuna, que comprende cultivar células infectadas con una cepa del virus de la fiebre amarilla modificado según la reivindicación 1.

9.- El método según la reivindicación 8, en el que las células son células Vero.

1.- El método según la reivindicación 9, que comprende además la etapa de tratar la cepa del virus de la fiebre amarilla modificado con un agente ¡nactivante, en el que el agente ¡nactlvante es preferiblemente beta-propiolactona.