Cápsides de AAVrh.64 modificado, composiciones que las contienen y usos de las mismas.

Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVrh.

64 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 43 modificada para contener un triptófano en la posición 697 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una arginina.

Cápsides de AAVrh.64 modificado, composiciones que las contienen y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención Un virus adeno-asociado (AAV) , un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineal de cadena simple de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El virus se asigna al género, Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, son el sitio específicamente integrado en cromosomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección ya sea por adenovirus o ya sea por virus de herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo las células que no se dividen, y la integración cromosómica potencial específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.

Los vectores de AAV han sido descritos para su uso como vehículos de suministro tanto para moléculas terapéuticas como inmunogénicas. Hasta la fecha, se han aislado varios AAVs diferentes bien caracterizados a partir de primates humanos o no humanos (NHP) .

Recientemente, los investigadores han descrito un gran número de AAVs de diferentes secuencias [G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (10) : 6081-6086 (13 de Mayo de 2003) ; US-2003-0138772-A1 (24 de Julio de 2003) ], y han caracterizado esos AAVs en diferentes serotipos y clados [G. Gao, et al., J. Virol., 78 (12) : 6381-6388 (Junio de 2004) ; publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321]. Se ha informado que diferentes AAVs presentan eficacias de transfección diferentes, y también presentan tropismo para diferentes células o tejidos.

Lo que resulta deseable son construcciones a base de AAV para el suministro de moléculas heterólogas a diferentes tipos de células.

Sumario de la invención La presente invención proporciona, en un aspecto, un vector de virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAVrh32/33 que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID Núm. 2, en la que el vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

El producto de gen puede ser, por ejemplo, un inmunógeno o un antígeno. En realizaciones particulares, el producto de gen se deriva de un inmunógeno o un antígeno viral.

El vector puede ser para uso en el suministro de un producto de gen a una célula anfitrión.

La invención se extiende también a una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un vector de AAV según se describe.

La invención se extiende además a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVrh32/33, que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2.

Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un gráfico que ilustra transducción 293 in vitro de vectores de AAV corregidos en singletón. Las correcciones de singletón están indicadas detrás del nombre del vector con, si está presente, un número para indicar el número de mutaciones realizadas.

Las Figuras 2A-2C son gráficos lineales que ilustran la titulación de vectores de AAV sobre células 293 en multiplicidades de rango de infección desde 101 a 104, con una comparación entre rh.8 parental y rh.8 corregido en singletón (rh.8R) en la Figura 2A, rh.37 parental y rh.37 modificado (Figura 2B) , y AAV2 y AAV8 en la Figura 2C. Como control, está presente una titulación similar de AAV2 y AAV2/8 eGFP que expresa el vector. El porcentaje (%) de células positivas de eGFP se presenta en el eje Y, y fue ensayado mediante citometría de flujo.

La Figura 3 es un árbol filogenético de secuencias de AAV, que indica su relación filogenética y clados.

Las Figuras 4A-4K son un alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 7], cy-5 [SEQ ID Núm. 8], rh.10 [SEQ ID Núm. 9], rh.13 [SEQ ID Núm. 10], AAV1 [SEQ ID Núm. 11], AAV3 [SEQ ID Núm. 12], AAV6 [SEQ ID Núm. 13], AAV7 [SEQ ID Núm. 14], AAV8 [SEQ ID Núm. 15], hu.13

[SEQ ID Núm. 16], hu.26 [SEQ ID Núm. 17], hu.37 [SEQ ID Núm. 18], hu.53 [SEQ ID Núm. 19], hu.39 [SEQ ID Núm. 20], rh.43 [SEQ ID Núm. 21], y rh.46 [SEQ ID Núm. 22].

Las Figuras 5A-5D son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 23], cy.5 [SEQ ID Núm. 24], rh.10 [SEQ ID Núm. 25], rh.13 [SEQ ID Núm. 26], AAV1 [SEQ ID Núm. 27], AAV3 [SEQ ID Núm. 28], AAV6 [SEQ ID Núm. 29], AAV7 [SEQ ID Núm. 30], AAV8 [SEQ ID Núm. 31], hu.13 [SEQ ID Núm. 32], hu.26 [SEQ ID Núm. 33], hu.37 [SEQ ID Núm. 34], hu.53 [SEQ ID Núm. 35], rh.39 [SEQ ID Núm. 36], rh.43 [SEQ ID Núm. 37] y rh.46 [SEQ ID Núm. 38].

Las Figuras 6A-6B son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de rh.13 [SEQ ID Núm. 26], rh.2 [SEQ ID Núm. 39], rh.8 [SEQ ID Núm. 41], hu.29 [SEQ ID Núm. 42] y rh.64 [SEQ ID Núm. 43].

Descripción detallada de la invención La presente invención fue concebida usando el “método de singletón” de la solicitante, el cual tiene como objetivo mejorar la producción de empaquetamiento, eficacia de transducción, y/o eficacia de transferencia de gen de un vector de AAV que tiene una cápside de un AAV que contiene uno o más singletones. Este método se describe con mayor detalle en lo que sigue y constituye también el objeto de la solicitud de Patente Europea núm. 06749685.1 (de la que deriva la presente solicitud por división) .

Según se utiliza a través de la presente descripción y de las reivindicaciones, los términos “comprendiendo” e “incluyendo” son inclusives de otros componentes, elementos, integradores, etapas y similares. A la inversa, el término "“consistiendo” y sus variantes son excluyentes de otros componentes, elementos, integradores, etapas y similares.

Método de singletón Según se utiliza en la presente memoria, el término “singletón” se refiere a un aminoácido variable en una posición dada en una secuencia de cápside de AAV seleccionada (es decir, parental) . La secuencia de un aminoácido variable se determina mediante alineamiento de la secuencia de la cápside de AAV parental con una librería de secuencias de cápside de AAV funcionales. Las secuencias son analizadas después para determinar la presencia de cualesquiera secuencias de aminoácido variables en la cápside de AAV parental donde las secuencias del AAV en la librería de AAVs funcionales tienen conservación completa. La secuencia de AAV parental es alterada a continuación para cambiar el singletón en el aminoácido conservado identificado en esa posición en las secuencias de cápside de AAV funcionales. Una secuencia de AAV parental puede tener 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 2 singletones. Una secuencia de AAV parental puede tener más de 6 singletones.

Una vez modificada, la cápside de AAV modificada puede ser usada para construir un vector de AAV que tenga la cápside modificada. Este vector puede ser construido usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

El AAV seleccionado para modificación según el método, es uno para el que resulta deseable incrementar una cualquiera o más de las tres propiedades funcionales siguientes de AAV, a saber, empaquetamiento en la partícula viral que tiene la cápside de la secuencia de AAV seleccionada, incremento de la eficacia de transducción, o incremento de la eficacia de transferencia de gen en comparación con el AAV parental. Por ejemplo, el AAV parental puede estar caracterizado por tener una eficacia de empaquetamiento más baja que otro AAV relacionado cercanamente. En otro ejemplo, el AAV parental puede tener una eficacia de transducción más baja en comparación con AAVs relacionados cercanamente. En otro ejemplo, el AAV parental puede tener una eficacia de transferencia de gen más baja (es decir, una capacidad más baja para suministrar una molécula objetivo in vivo) en comparación con AAVs relacionados cercanamente. En otros ejemplos, el AAV parental está caracterizado por una función adecuada en cada una de esas categorías, pero una o más áreas de función incrementada si se desea.

De ese modo, el método proporciona... [Seguir leyendo]

1. Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVrh.64 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 43 modificada para contener un triptófano en la posición 697 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una arginina.

2. El vector viral de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

3. Una composición que comprende un vector de AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y un portador fisiológicamente compatible.

4. Un vector de AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para su uso en el suministro de un producto de gen a un sujeto.

5. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVrh.64 modificada que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 43 modificada para contener un triptófano en la posición 697 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una arginina.

6. La molécula de +acido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, la cual es un plásmido.