Biorreactor de perfusión para cultivar células en materiales estructurales.

Biorreactor de perfusión (1) para cultivar células en materiales sólidos de estructura con una cámara de cultivo (4) para alojar el material estructural,

donde

- la cámara de cultivo (4) se encuentra conformada en una carcasa (2) y la superficie circunferencial de la cámara de cultivo (4) se encuentra formada desde la pared interna de la carcasa (2) y en los lados frontales de la carcasa (2) se encuentran formadas aberturas de la carcasa (7,7') para alojar elementos de cierre (8) que pueden ser insertados en las aberturas de la carcasa (7,7') de manera hermética,

- los elementos de cierre (8) presentan aberturas (11) a modo de canales para suministrar y descargar un medio de cultivo y la abertura (11) a modo de canal de uno de los dos elementos de cierre (8) presenta una sección que disminuye desde el lado frontal del elemento de cierre (8) que se encuentra orientado hacia la cámara de cultivo (4), en la dirección del lado frontal del elemento de cierre (8) que se encuentra distanciado de la cámara de cultivo (4); y la carcasa (2) presenta una primera sección cilíndrica (3) y segundas secciones tubulares (6, 6') que se sitúan de forma adyacente con respecto a la primera sección cilíndrica (3), donde en la primera sección cilíndrica (3) se encuentra conformada una cavidad abierta en sus lados frontales, cuya pared forma la superficie circunferencial de la cámara de cultivo (4), y donde los elementos de cierre (8) pueden ser insertados en las segundas secciones tubulares (6, 6') mediante las aberturas de la carcasa (7, 7').

Biorreactor de perfusión para cultivar células en materiales estructurales La presente invención hace referencia a un biorreactor de perfusión para cultivar células en materiales estructurales, así como a un sistema de biorreactor de perfusión que comprende un biorreactor de perfusión de ese tipo.

En el campo de la ingeniería de tejidos ("Tissue Engineering") los biorreactores se utilizan entre otras cosas para producir tejidos de sustitución (Ratcliffe y otros, Bioreactors and bioprocessing for tissue engineering, Ann N Y Acad Sci., 2002, 5) . Los biorreactores deben estimular in vitro el desarrollo de tejido nuevo, proporcionando estimulantes adecuados, entre otros factores de crecimiento y fuerzas de corte dinámicas, durante el cultivo de las células tisulares, gracias a lo cual -a diferencia de los cultivos de células bidimensionales -se produce un cultivo de tejidos dinámico tridimensional. Un biorreactor conocido desde hace ya tiempo y que puede utilizarse con facilidad es la botella giratoria, la cual posibilita un cultivo tridimensional de células sobre microportadores porosos. Para ello, los materiales estructurales se sujetan con agujas y se colocan en una botella giratoria llenada con un medio de cultivo, en cuya base un agitador magnético se encarga de producir un movimiento de la solución de cultivo alrededor de los materiales estructurales poblados de células (véase por ejemplo Stiehler y otros, Effect of dynamic 3-D culture on proliferation, distribution, and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells, J Biomed Mater Res A, 2008, 96, 98) . Por lo general la solución de cultivo se cambia varias veces, por ejemplo dos veces por semana. El cultivo en un dispositivo de este tipo se asocia a un flujo no-homogéneo de los materiales estructurales con medio de cultivo celular, celularmente poblados, así como a fuerzas de corte igualmente no-homogéneas que actúan de forma dinámica dentro de las construcciones de célula/portador.

Los así llamados biorreactores de perfusión han sido propuestos para asegurar en primer lugar una penetración segura en materiales estructurales con medio de cultivo y en segundo lugar fuerzas de corte dinámicas que actúen de forma dinámica con una distribución homogénea sobre toda la sustancia portadora. En su forma más sencilla, un biorreactor de este tipo se compone de una cámara tubular en la cual se introducen los materiales estructurales de poros abiertos, poblados con células. El medio de cultivo es transportado a través de la cámara mediante una bomba, debido a lo cual el medio de cultivo es transportado de forma continua a través de los poros del material estructural (véase Bancroft y otros, Design of a Flow Perfusion Bioreaktor System for Bone Tissue-Engineering Applications, Tissue Engineering, 2003, 9 (3) , 549, 550) . Se considera esencial que el medio de cultivo fluya a través de los poros reticulados entre sí de los materiales estructurales y que no sea transportado cerca de las superficies delimitadoras entre los materiales estructurales y la pared de la cámara, por delante de los materiales estructurales. Una conducción del flujo de este tipo se denomina también "flujo forzado". El flujo a través de los poros reticulados de los materiales estructurales posibilita un suministro comparativamente bueno de las células aplicadas sobre los materiales estructurales, las cuales se encuentran en los poros, así como una evacuación de productos de degradación que son producidos por las células.

Para abastecer un biorreactor de perfusión de este tipo con medio de cultivo pueden proporcionarse un primer y un segundo depósito de medios. Mediante la bomba, por ejemplo una bomba peristáltica, el medio de cultivo es bombeado por un conducto desde el primer depósito de medios hacia la cámara de cultivo, ingresando a la misma por el lado frontal superior a través de una abertura. En la cámara de cultivo el medio de cultivo atraviesa del modo antes descrito el material estructural celularmente poblado que se encuentra en el lugar y finalmente abandona la cámara de cultivo mediante una abertura en su lado frontal inferior. Mediante otro conducto, el medio de cultivo alcanza entonces el segundo depósito de medios, el cual se encuentra conectado al primer depósito de medios a través de un conducto, permitiendo el intercambio del medio de cultivo circulante, así como un intercambio de gas entre el aire ambiente y el medio de cultivo (Bancroft y otros, ibídem, 552 y siguiente) .

Un sistema de biorreactor de perfusión de esta clase posibilita un cultivo dinámico de las células sobre los materiales estructurales. El término "dinámico" hace referencia al hecho de que los materiales estructurales son atravesados por el flujo, mientras que en el caso de un cultivo estático no se fuerza ningún movimiento del medio de cultivo. El sistema de biorreactor de perfusión garantiza un abastecimiento suficiente de las células con oxígeno y nutrientes, proporcionando adicionalmente del modo descrito un estímulo para la maduración celular.

Mediante los biorreactores de perfusión podría generarse un entorno de cultivo con un flujo semejante a las condiciones in vivo en el cuerpo humano. Sin embargo, eso requiere una regulación cuidadosa de las condiciones del cultivo, así como un control continuo de esas condiciones. Los biorreactores de perfusión conocidos no son lo suficientemente adecuados para ese objetivo, puesto que un control de las condiciones del cultivo en la cámara de cultivo no es posible o sólo es difícilmente posible.

Volkmer y otros, en su artículo científico "Hypoxia in Static and Dynamic 3D Culture Systems for Tissue Engineering of Bone" (Tissue Engineering, 2008, 14 (8) , 1331, 1332 y siguiente) describen un reactor de perfusión con perfusión forzada, en donde una sonda para medir la presión parcial del oxígeno es introducida en la cámara de cultivo. En dicha descripción la punta de la sonda se encontraba en el centro geométrico del material estructural presente en la cámara de cultivo. Para introducir la sonda fue perforado un orificio en la pared de la cámara. Por lo tanto, este

biorreactor de perfusión no es apropiado para la práctica diaria. Además, una adaptación del reactor a los materiales estructurales con diferentes dimensiones sólo es posible con una inversión elevada.

Los biorreactores de perfusión han sido utilizados para producir tejidos óseos de sustitución. Para ello, los materiales estructurales óseos (denominados también como materiales soporte) son poblados con células precursoras óseas. El flujo a través de los materiales estructurales en el biorreactor de perfusión posibilita una maduración ósea de las células precursoras óseas. No obstante, para la aplicación clínica, para curar defectos óseos de mayor tamaño, es necesario utilizar materiales óseos vitales de estructura de una dimensión mayor. Sin embargo, los biorreactores de perfusión conocidos, debido a su estructura, sólo son adecuados para producir tejidos óseos de sustitución de un tamaño comparativamente reducido.

En la práctica clínica es además necesario proporcionar implantes, por ejemplo tejidos óseos de sustitución, de los tamaños más diversos. Se consideraría además deseable que los implantes presentaran dimensiones que sean determinadas directamente por el tamaño del defecto óseo a ser curado y no sólo por el tamaño de la cámara de cultivo del biorreactor. No obstante, una adaptación de los biorreactores de perfusión conocidos para producir un implante del tamaño deseado no es posible o sólo es difícilmente posible debido a la estructura rígida de esos biorreactores de perfusión. A modo de ejemplo, Bancroft y otros, ibídem, 552, prevén la utilización de tubos con diámetros diferentes, los cuales deben utilizarse como casetes en la cámara de cultivo. Las posibilidades alternativas para tratar defectos del tejido de gran tamaño combinando tejidos óseos de sustitución más pequeños producidos de forma simultánea, se asocian además a la desventaja de una estabilidad mecánica disminuida de las construcciones combinadas de ese modo, lo cual a su vez representa un riesgo aumentado de un fracaso del implante.

Por último, un requerimiento elemental de la práctica clínica consiste en la utilización solamente de componentes asépticos, lo cual implica una esterilización del biorreactor de perfusión, así como del resto de los componentes del sistema de reactor. A este respecto se considera deseable una capacidad de esterilización lo más simple posible del sistema de reactor de perfusión, lo cual no es posible o sólo es difícilmente posible en el caso de los reactores de perfusión y sistemas de reactores de perfusión conocidos.

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1. Biorreactor de perfusión (1) para cultivar células en materiales sólidos de estructura con una cámara de cultivo (4) para alojar el material estructural, donde -la cámara de cultivo (4) se encuentra conformada en una carcasa (2) y la superficie circunferencial de la cámara de cultivo (4) se encuentra formada desde la pared interna de la carcasa (2) y en los lados frontales de la carcasa (2) se encuentran formadas aberturas de la carcasa (7, 7â?) para alojar elementos de cierre (8) que pueden ser insertados en las aberturas de la carcasa (7, 7â?) de manera hermética, -los elementos de cierre (8) presentan aberturas (11) a modo de canales para suministrar y descargar un medio de cultivo y la abertura (11) a modo de canal de uno de los dos elementos de cierre (8) presenta una sección que disminuye desde el lado frontal del elemento de cierre (8) que se encuentra orientado hacia la cámara de cultivo (4) , en la dirección del lado frontal del elemento de cierre (8) que se encuentra distanciado de la cámara de cultivo (4) ; y la carcasa (2) presenta una primera sección cilíndrica (3) y segundas secciones tubulares (6, 6â?) que se sitúan de forma adyacente con respecto a la primera sección cilíndrica (3) , donde en la primera sección cilíndrica (3) se encuentra conformada una cavidad abierta en sus lados frontales, cuya pared forma la superficie circunferencial de la cámara de cultivo (4) , y donde los elementos de cierre (8) pueden ser insertados en las segundas secciones tubulares (6, 6â?) mediante las aberturas de la carcasa (7, 7â?) .

2. Biorreactor de perfusión según la reivindicación 1, caracterizado porque los ejes longitudinales de la primera sección cilíndrica (3) y las segundas secciones tubulares (6, 6â?) se sitúan sobre una línea recta, los diámetros internos de las segundas secciones tubulares (6, 6â?) son iguales o desiguales con relación al de la primera sección (3) .

3. Biorreactor de perfusión según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos uno de los elementos de cierre (8) presenta un cuerpo de inserción (17) con una superficie externa que se encuentra diseñada de forma complementaria con respecto a una abertura de la carcasa (8) y soporta al menos un elemento de junta (19) para hermetizar la superficie delimitadora entre la superficie externa del cuerpo de inserción (17) y la superficie circunferencial interna de la abertura de la carcasa (7, 7") .

4. Biorreactor de perfusión según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos uno de los elementos de cierre (8) se encuentra diseñado de dos piezas, donde la primera pieza consiste en un cuerpo base

(9) esencialmente cilíndrico, en donde se encuentra conformada la abertura (11) a modo de un canal para el suministro y la descarga de un medio de cultivo, y la segunda pieza consiste en un manguito (10) que se encuentra fijado de forma separable al cuerpo base (9) y cuya superficie circunferencial se encuentra en contacto hermético con la carcasa (2) cuando el elemento de cierre (8) está inserto en la carcasa (2) .

5. Biorreactor de perfusión según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque éste comprende además un elemento soporte (23) para una sonda (28) , donde el elemento soporte (28) puede insertarse en la carcasa (2) de manera que la sonda (28) puede ser introducida en la cámara de cultivo (4) a través de una abertura para la sonda (27) en la carcasa (2) .

6. Biorreactor de perfusión según la reivindicación 5, caracterizado porque el elemento soporte (23) presenta una primera perforación (24) que es complementaria con respecto a la pared externa de la carcasa (2) al menos en el área de la cámara de cultivo (4) , y una segunda perforación (25) , cuyo eje longitudinal se extiende de forma ortogonal con respecto al eje longitudinal de la primera perforación, donde un soporte de la sonda (26) es conducido a través de la segunda perforación (25) .

7. Biorreactor de perfusión según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la carcasa (2) se encuentra conformada de una o de dos piezas, donde una carcasa (2) de dos piezas comprende un primer elemento de la carcasa (2a) y un segundo elemento de la carcasa (2b) , los cuales pueden conectarse uno con otro de forma separable en el área de la cámara de cultivo (4) .

8. Biorreactor de perfusión según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la carcasa (2) se encuentran dispuestos uno o más elementos de mediación (22) anulares, respectivamente entre un lado frontal de la cámara de cultivo (4) y el elemento de cierre (8) que se encuentra orientado hacia ese lado frontal, los cuales sirven para guiar el medio de cultivo entre el lado frontal de la cámara de cultivo (4) y las aberturas (11) a modo de canales de los elementos de cierre (8) .

9. Biorreactor de perfusión según la reivindicación 8, caracterizado porque el diámetro interno de un elemento de mediación (22) disminuye desde el lado frontal de la cámara de cultivo (4) en la dirección del elemento de cierre (8) orientado en este sentido, donde el diámetro interno del elemento de mediación (22) anular en el lado frontal que se sitúa de forma adyacente con respecto al lado frontal de la cámara de cultivo (4) corresponde al diámetro en ese

lugar de la cámara de cultivo (4) , y en el lado frontal que se sitúa de forma adyacente con respecto al elemento de cierre (8) corresponde al diámetro en ese lugar de la abertura (11) a modo de un canal.

10. Biorreactor de perfusión según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos la carcasa (2) , los elementos de cierre (8) y, en caso de estar previsto, las juntas (19) y los elementos de mediación 5 (22) , se encuentran realizados de un material plástico que puede ser autoclavado.

11. Sistema de biorreactor de perfusión (100) , el cual comprende un biorreactor de perfusión (101) según una de las reivindicaciones 1 a 10, una bomba (104) para transportar un medio de cultivo a través del biorreactor de perfusión (101) , así como al menos una célula de medición de flujo (105) para medir la presión parcial del oxígeno en el medio de cultivo, donde la célula de medición de flujo (105) se encuentra dispuesta inmediatamente aguas arriba o 10 aguas abajo del biorreactor de perfusión (101) , con respecto a la dirección de flujo del reactor (105) .