Biodetección de conformación molecular.

Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra líquida de biomoléculas que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un sensor de ondas acústicas en fase líquida para generar una onda acústica, sensor de ondas acústicas que tiene una superficie sensora;

(ii) realizar una primera medida de la primera y segunda señales, donde la primera señal está relacionada con las pérdidas de energía de una onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas y la segunda señal está relacionada con la frecuencia o fase de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas;

(iii) adherir biomoléculas de la muestra líquida de forma discreta sobre la superficie sensora;

(iv) realizar una segunda medida de la primera y segunda señales;

(v) calcular un parámetro de conformación a partir del cambio de la primera y segunda señales entre la primera y segunda medida, donde el parámetro de conformación está relacionado con la conformación de dichas biomoléculas que son adheridas de forma discreta a la superficie sensora entre la primera y la segunda medida, pero sustancialmente independiente del cambio en la carga másica de la superficie sensora entre la primera y la segunda medida.

Biodetección de conformación molecular

Campo de la invención La invención se refiere a métodos para determinar información relativa a la conformación de una muestra de biomoléculas usando un sensor de ondas acústicas en fase líquida. La invención también puede usarse para determinar información relativa a un cambio en la conformación de una muestra de biomoléculas tras una interacción.

Antecedentes de la invención La presente invención aborda el problema de la determinación de información relativa a la conformación de biomoléculas y a cambios en la conformación de biomoléculas como resultado de una interacción con una especie química, tal como una macromolécula o ligando biológicos.

La conformación de biomoléculas afecta a sus interacciones químicas, y se ve afectada por ellas. Por ejemplo, la unión de proteínas afecta a la forma y a la actividad del ADN; se ha demostrado que el flexionamiento proteína-ADN facilita la formación de complejos de proteínas nucleares y desempeña un papel fundamental en el control de la transcripción y la replicación. Inversamente, el flexionamiento intrínseco de ADN y la deformabilidad inherente asociada a secuencias de bases específicas puede afectar al reconocimiento y unión de proteínas. El nivel hasta el cual el ADN se flexiona de forma intrínseca y la interacción con proteínas son el objeto del presente estudio. Unos métodos rápidos para la detección del flexionamiento de ADN facilitarían este proceso. Unos métodos rápidos para la detección del flexionamiento de ADN facilitarían el escrutinio de fármacos potenciales que tengan un modo de acción que implique un cambio en la conformación de ADN, por ejemplo, fármacos que afecten a la transcripción y a la regulación afectando al flexionamiento producido por proteínas.

Aunque la invención se discutirá más detalladamente en referencia a la determinación de información relativa a la conformación de ADN de doble cadena, y a los cambios en la conformación del ADN de doble cadena originados por interacciones del ADN de doble cadena, la invención es relevante para la determinación de información relativa a la conformación de otras macromoléculas biológicas, tal como proteínas, ARN, ADNss, etc. y a los cambios en su conformación originados por interacciones.

Los métodos empleados comúnmente para medir la curvatura de ADN incluyen ensayos de movilidad electroforética y ensayos de ciclación basados en mediciones de la velocidad con la que el ADN puede formar círculos cerrados sellados enzimáticamente. Sin embargo, puede ser difícil interpretar los resultados de estos ensayos. Las estructuras cristalinas tri-dimensionales de los complejos ADN-proteína proporcionan una visión detallada del mecanismo del flexionamiento de ADN producido por proteínas, pero esta información solo puede obtenerse tras un proceso largo y laborioso. El análisis estructural basado en disolución por RMN proporcionará asimismo información detallada, pero dichos métodos no son aplicables en todos los casos y no son adecuados para ensayos rápidos. La información estructural puede obtenerse a partir de imágenes de microscopio de fuerza atómica, pero la resolución es baja.

Mediante fluorescencia se ha estudiado ADN funcionalizado en los extremos para caracterizar la conformación de moléculas de ADN tanto pequeñas como grandes. Se ha usado microscopía confocal de moléculas de ADN grandes con colorante intercalado para proporcionar evidencias de que el radio de giro de moléculas funcionalizadas en el extremo es el mismo que el de moléculas en disolución. Las mediciones de interferencia de fluorescencia con ADN corto marcado en el extremo con un fluoróforo proporcionan una medida de la altura del marcador fluorescente dentro la estructura de ADN, lo que puede proporcionar una evidencia indirecta sobre la inclinación del ADN marcado en el extremo, sobre la forma del ADN de cadena sencilla y sobre el grado de hibridación. Sin embargo, una desventaja de estas técnicas es que requieren un marcador y solo proporcionan información limitada relativa a la conformación.

Por consiguiente, la invención está dirigida a proporcionar un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas y a los cambios en la conformación de biomoléculas producidos por una interacción con un agente (tal como otra biomolécula o una entidad química) , que sea adecuado para sensores sin marcadores. La invención se puede usar para un escrutinio rápido y/o paralelo, aunque también puede usarse para estudiar la conformación de una molécula específica o el cambio de conformación de una molécula específica tras una interacción específica. Algunas realizaciones de la invención proporcionan información en tiempo real relativa a la conformación.

Aunque la invención se discutirá más detalladamente en referencia a la determinación de información relativa a la conformación de biomoléculas y a los cambios en la conformación de biomoléculas originados por interacciones de las biomoléculas usando un sensor de ondas acústicas de cizalladura, la invención se puede llevar a cabo usando otros tipos de sensor de ondas acústicas en fase líquida. Por "sensor de ondas acústicas en fase líquida" se pretende indicar un sensor de ondas acústicas en el que la superficie sensora del sensor de ondas acústicas está en contacto con un líquido en uso.

Es conocido el uso de un sensor de ondas acústicas de cizalladura para investigar las propiedades de capas de material que están adheridas a una superficie sensora del sensor, y se ha usado para detectar la presencia de moléculas diana que se unen selectivamente a la superficie sensora (por ejemplo, WO03/100412 (Atonomics aps) , WO 97/41424 (Pence Inc.) , Fortado et al. (ANALYTICAL Chemistr y , vol. 71, nº 6, páginas 1167-1175, 515 marzo de 1999) y WO 2005/0501064 (Georgia Tech Res Inst) ) . Los sensores de ondas acústicas de cizalladura sondean la respuesta de una capa fina unida a la superficie del dispositivo frente a un desplazamiento mecánico y, por tanto, son sensibles a las propiedades mecánicas de la capa y del medio líquido que se encuentra dentro de la profundidad de penetración de la onda acústica de la superficie sensora (véase, por ejemplo, Cooper et al. (Journal of Molecular Recognition, vol. 20, nº 3, páginas 154-184, mayo de 2007) , que discute los usos, y la teoría subyacente, de sensores acústicos piezoeléctricos) ) . La interacción entre ondas acústicas en modo de cizalladura y capas elásticas continuas fijadas firmemente, tal como láminas metálicas y/o disoluciones viscosas homogéneas ha sido descrita ampliamente tanto teórica como experimentalmente. La viscosidad de una capa superficial de biomoléculas dependerá, entre otras cosas, de la conformación de las biomoléculas, y se sabe que determina la viscosidad de una capa superficial que está unida a la superficie sensora de un dispositivo de ondas acústicas de cizalladura. Por ejemplo, Xiaomeng Wang et al (Molecular Biosystems, vol. 2, nº 3-4, páginas 184-192, marzo de 2006) describen la medida de un desplazamiento de conformación en una capa de calmodulina, Zhou et al. (Langmuir vol. 20, nº 14, páginas 5870-5818, 8 de junio 2004) describe el estudio de adsorción de inmunoglobulina humana.

Sin embargo, hasta la fecha, las biomoléculas unidas a la superficie sensora de un dispositivo de onda acústica de cizalladura se han analizado como si formaran una capa viscoelástica homogénea en la que la señal medida incluye contribuciones tanto de las biomoléculas inmovilizadas como de las moléculas de disolvente que estén atrapadas entre las biomoléculas inmovilizadas. Se han modelizado capas viscoelásticas usando los modelos mecánicos simples de Maxwell o Voigt para una capa viscoelástica, en los que se trata la capa como si estuviera compuesta por muelles elásticos y amortiguadores viscosos. Estos modelos se han usado para derivar información relativa a la viscosidad y al módulo de cizalla de la lámina sin hacer referencia alguna a la conformación específica de las biomoléculas de la lámina sensora.

La invención está dirigida a proporcionar una nueva estrategia para usar sensores de onda acústica en fase líquida para investigar la conformación de biomoléculas, y los cambios en la conformación de biomoléculas originados por interacciones, y una nueva estrategia para analizar las señales producidas por sensores de ondas acústicas en fase líquida, lo que facilita la investigación de la conformación de biomoléculas, y de los cambios en la conformación de biomoléculas originados por interacciones.

En la presente especificación y en las reivindicaciones anexas, las referencias a proteínas, ARN,... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra líquida de biomoléculas que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un sensor de ondas acústicas en fase líquida para generar una onda acústica, sensor de ondas acústicas que tiene una superficie sensora;

(ii) realizar una primera medida de la primera y segunda señales, donde la primera señal está relacionada con las pérdidas de energía de una onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas y la segunda señal está relacionada con la frecuencia o fase de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas;

(iii) adherir biomoléculas de la muestra líquida de forma discreta sobre la superficie sensora;

(iv) realizar una segunda medida de la primera y segunda señales;

(v) calcular un parámetro de conformación a partir del cambio de la primera y segunda señales entre la primera y segunda medida, donde el parámetro de conformación está relacionado con la conformación de dichas biomoléculas que son adheridas de forma discreta a la superficie sensora entre la primera y la segunda medida, pero sustancialmente independiente del cambio en la carga másica de la superficie sensora entre la primera y la segunda medida.

2. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según la reivindicación 1, en el que el parámetro de conformación calculado es independiente del valor absoluto de carga másica de la superficie sensora, en un rango de operación de carga másica de la superficie sensora.

3. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende la etapa de adherir biomoléculas procedentes de una segunda muestra de forma discreta a la superficie sensora, hacer una tercera medida de la primera y segunda señales y calcular un segundo parámetro de conformación a partir del cambio en la primera y segunda señales entre la medida llevada a cabo antes de la adhesión discreta de biomoléculas adicionales y la tercera medida, donde el segundo parámetro de conformación está relacionado con la conformación de las biomoléculas procedentes de la segunda muestra que son adheridas de forma discreta a la superficie sensora pero sustancialmente independiente de la carga másica de la superficie sensora entre la medida llevada a cabo antes de la adhesión discreta de las biomoléculas adicionales y la tercera medida.

4. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera señal está relacionada con la amplitud y/o la disipación de energía de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas.

5. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según la reivindicación 3, en el que la medida llevada a cabo antes de la adhesión de biomoléculas adicionales es la segunda medida.

6. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el parámetro de conformación calculado está relacionado con la conformación o rango de conformaciones que podrían haber conducido al parámetro de conformación calculado y/o está relacionado con un parámetro de forma que describe la forma de las biomoléculas adheridas.

7. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sensor de ondas acústicas en fase líquida es un dispositivo de tipo Onda Acústica en Masa, la segunda señal está relacionada con la frecuencia de las oscilaciones del sensor de ondas acústicas y la primera señal está relacionada con la disipación de energía de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústica y/o el sensor de ondas acústicas en fase líquida es un dispositivo de tipo Onda Acústica Superficial, la primera señal está relacionada con la amplitud de la onda acústica superficial generada por el sensor de ondas acústicas y la segunda señal está relacionada con la fase de la onda acústica superficial generada por el sensor de ondas acústicas.

8. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de calcular un parámetro de conformación a partir del cambio en la primera y segunda señales entre la primera y segunda medidas usa una correlación entre el parámetro de conformación y la primera y segunda señales que asume una interacción mínima o nula entre biomoléculas adheridas adyacentes.

9. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el parámetro de conformación es la relación acústica, o un parámetro que esté relacionado directamente con la relación acústica.

10. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el parámetro de conformación se compara con un valor o rango de valores predeterminados.

11. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la superficie sensora comprende un agente de unión que se une no específicamente a una clase de biomoléculas, una molécula de reconocimiento que se une específicamente a las biomoléculas, un agente de unión que se une no específicamente a un marcador que está unido a las biomoléculas o una molécula de reconocimiento que se une específicamente a un marcador que está unido a las biomoléculas.

12. Un método para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra de biomoléculas según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende calcular un parámetro de conformación de medida relacionado con una muestra medida de biomoléculas que ha sido sometida a una interacción con un agente, y calcular un parámetro de conformación de control relativo a una muestra de control de biomoléculas correspondientes que no han sido sometidas a una interacción con un agente y determinar la diferencia entre el parámetro de conformación medido y el parámetro de conformación de control.

13. Un aparato biosensor para determinar información relativa a la conformación de biomoléculas en una muestra líquida de biomoléculas, comprendiendo el aparato un sensor de ondas acústicas en fase líquida para generar una onda acústica:

presentando el sensor de ondas acústicas una superficie sensora que se puede operar para generar una primera señal y una segunda señal, donde la primera señal está relacionada con las pérdidas de energía de una onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas y la segunda señal está relacionada con la frecuencia o la fase de las oscilaciones de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas, comprendiendo adicionalmente el aparato un sistema de procesamiento de datos que esté adaptado para calcular un parámetro de conformación a partir del cambio en la primera y la segunda señales entre la primera medida y una segunda medida, donde el parámetro de conformación está relacionado con la conformación de dichas biomoléculas que están adheridas de forma discreta a la superficie sensora entre el tiempo en el que se realiza la primera medida y el tiempo en el que se realiza la segunda medida, pero es sustancialmente independiente del cambio en la carga másica de la superficie sensora entre la primera y la segunda medidas; o presentando el sensor de ondas acústicas una superficie sensora que está en contacto con un líquido y a la cual se puede adherir de forma discreta una muestra de biomoléculas, pudiéndose operar el aparato biosensor para generar una primera señal y una segunda señal, donde la primera señal está relacionada con las pérdidas de energía de una onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas y la segunda señal está relacionada con la frecuencia o la fase de las oscilaciones de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas, comprendiendo adicionalmente el aparato un sistema de procesamiento de datos que esté adaptado para calcular un parámetro de conformación a partir del cambio en la primera y la segunda señales entre la primera medida y una segunda medida, donde el parámetro de conformación está relacionado con el cambio en la conformación de una proporción de las biomoléculas que están adheridas de forma discreta a la superficie sensora entre el tiempo en el que se realiza la primera medida y el tiempo en el que se realiza la segunda medida, pero es sustancialmente independiente de cualquier cambio en la carga másica de la superficie sensora entre la primera y la segunda medidas.

14. Un método para determinar información relativa a cambios en la conformación de biomoléculas originados por su interacción con un agente que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un sensor de ondas acústicas en fase líquida para generar una onda acústica, sensor de ondas acústicas que tiene una superficie sensora en contacto con un líquido, con biomoléculas adheridas de forma discreta a la superficie sensora;

(ii) realizar una primera medida de la primera y segunda señales, donde la primera señal está relacionada con las pérdidas de energía de una onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas y la segunda señal está relacionada con la frecuencia o fase de la onda acústica generada por el sensor de ondas acústicas;

(iii) presentar el agente a las biomoléculas que están adheridas de forma discreta a la superficie sensora;

(iv) realizar una segunda medida de la primera y segunda señales; y

(v) calcular un parámetro de conformación a partir del cambio de la primera y segunda señales entre la primera y segunda medida, donde el parámetro de conformación está relacionado con el cambio de conformación de biomoléculas adheridas que cambian de conformación entre la primera y la segunda medidas, como resultado de su interacción con el agente, pero sustancialmente independiente de cualquier cambio en la carga másica de la superficie sensora entre la primera y la segunda medida.