Bibliotecas de paquetes genéticos que comprenden nuevos diseños de CDR1, CDR2, y CDR3 de HC y nuevos diseños de CDR1, CDR2, y CDR3 de LC.

Una biblioteca de vectores o paquetes genéticos que presentan,

presentan y expresan, o comprenden un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos y proteínas relacionados con anticuerpos humanos, y colectivamente presentan, presentan y expresan, o comprenden al menos una porción de la diversidad de la familia de anticuerpos, en la que los vectores o paquetes genéticos comprenden secuencias de ADN variegadas que codifican:

(i) una cadena pesada, que comprende:

(a) una CDR1 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: X31YX33MX35, en la que X31, X33 y X35 son cualquier aminoácido excepto Cys o Met;

(b) una CDR2 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: X50IX52X52aSGGX56TX58YADSVKG, en la que X50, X52, X56 y X58 son cualquier aminoácido excepto Cys o Met, y X52a se selecciona del grupo que consiste en Gly, Ser, Pro o Tyr; y

(c) una CDR3; y

(ii) una cadena ligera.

Bibliotecas de paquetes genéticos que comprenden nuevos diseños de CDR1, CDR2, y CDR3 de HC y nuevos diseños de CDR1, CDR2, y CDR3 de LC

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud U.S. Serie nº 61/047.529, presentada el 24 de abril de 2008. La descripción de la solicitud previa se considera parte de la descripción de esta solicitud.

ANTECEDENTES

Actualmente es práctica corriente en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan individualmente, presentan y expresan, o comprenden un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas, y en conjunto presentan, presentan y expresan, o comprenden al menos una porción de la diversidad de aminoácidos de la familia. En muchas bibliotecas corrientes, los péptidos, polipéptidos o proteínas están relacionados con anticuerpos (por ejemplo, Fv monocatenario (scFv) , Fv, Fab, anticuerpos o minicuerpos completos (es decir, dímeros constituidos por VH unida a VL) ) . A menudo, comprenden una o más de las CDRs y regiones del marco de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanos.

Las bibliotecas de péptidos, polipéptidos o proteínas se han producido de muchas maneras. Véase, por ejemplo, Knappik et al., J. Mol. Biol., 296, págs. 57-86, (2000) , que se incorpora a la presente memoria como referencia. Un método consiste en capturar la diversidad de donantes nativos, ya sea sin tratamiento previo o inmunizados. Otra manera consiste en generar bibliotecas con diversidad sintética. Un tercer método es una combinación de los dos primeros. Por lo general, la diversidad producida por estos métodos se limita a la diversidad de secuencias, es decir, cada miembro de la biblioteca tiene la misma longitud pero difierer de los otros miembros de la familia porque tiene diferentes aminoácidos o variegación en una posición dada en la cadena peptídica, polipeptídica o proteica. Los péptidos, polipéptidos o proteínas naturalmente diversos, sin embargo, no se limitan a la diversidad solamente en sus secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, los anticuerpos humanos no se limitan a la diversidad de secuencias en sus aminoácidos; también son diversos en las longitudes de sus cadenas de aminoácidos.

Hoet et al., Nature Biotechnology, Vol. 23 (3) , 1 de marzo de 2005, páginas 344-348, describe la generación de anticuerpos humanos de alta afinidad combinando una diversidad de regiones determinantes de la complementariedad derivadas de donantes y sintéticas.

Para anticuerpos, la diversidad en longitud de la cadena pesada se produce, por ejemplo, durante las reorganizaciones de la región variable. Véase, por ejemplo, Corbett et al., J. Mol. Biol., 270, págs. 587-97 (1997) . La unión de los genes V con los genes J, por ejemplo, da como resultado la inclusión de un segmento D reconocible en CDR3 en alrededor de la mitad de las secuencias de anticuerpos de cadena pesada, creando de este modo regiones que codifican longitudes variables de aminoácidos. Los segmentos D son más habituales en anticuerpos que tienen CDR3s de HC largas. Lo siguiente también puede producirse durante la unión de los segmentos génicos del anticuerpo: (i) el extremo del gen V puede tener cero o varias bases suprimidas o cambiadas; (ii) el extremo del segmento D puede tener cero a muchas bases eliminadas o cambiadas; (iii) numerosas bases aproximadamente al azar pueden insertarse entre V y D o entre D y J; y (iv) se puede editar el extremo 5’ de J para eliminar o cambiar varias bases. Estas reorganizaciones dan como resultado anticuerpos que son diversos tanto en la secuencia de aminoácidos como en longitud. Las CDR3s de HC de diferentes longitudes se pueden plegar en diferentes formas, dando las nuevas formas de anticuerpos con los que se unirán los antígenos. Las conformaciones dependen tanto de la longitud como de la secuencia de la CDR3. Se debería recordar que una CDR3 de HC de longitud 8, por ejemplo, y de cualquier secuencia no puede imitar adecuadamente el comportamiento de una CDR3 de longitud 22, por ejemplo.

Las bibliotecas que contienen solamente diversidad de secuencia de aminoácidos están, de este modo, en desventaja por cuanto no reflejan la diversidad natural del péptido, polipéptido o proteína que la biblioteca pretende imitar. Además, la diversidad en longitud puede ser importante para el funcionamiento en última instancia de la proteína, péptido o polipéptido. Por ejemplo, con respecto a una biblioteca que comprende regiones de anticuerpos, muchos de los péptidos, polipéptidos, proteínas presentados, presentados y expresados, o comprendidos por paquetes genéticos de la biblioteca no pueden plegarse de manera apropiada, o su unión a un antígeno puede resultar desventajosa, si la diversidad tanto en la secuencia como en la longitud no están representadas en la biblioteca.

Otro inconveniente adicional de tales bibliotecas de paquetes genéticos que presentan, presentan y expresan, o comprenden péptidos, polipéptidos y proteínas es que no están focalizadas en aquellos miembros que están basados en la diversidad de origen natural y de este modo en los miembros que es más probable que sean funcionales y menos probable que sean inmunogénicos. Más bien, las bibliotecas, típicamente, intentan incluir tanta diversidad o variegación en cada posición de CDR como sea posible. Esto hace que la construcción de la biblioteca emplee mucho tiempo y sea menos eficiente de lo necesario. El gran número de miembros que se producen tratando de capturar la diversidad completa también hace la identificación más problemática de lo que sería

necesario. Esto es particularmente cierto dado que muchos miembros de la biblioteca no serán funcionales y serán pegajosos de forma no específica.

Además de la labor de construir bibliotecas sintéticas está la cuestión de la inmunogenicidad. Por ejemplo, hay bibliotecas en las que todos los restos de CDR son Tyr (Y) o Ser (S) . Aunque los anticuerpos (Abs) seleccionados de estas bibliotecas muestran afinidad y especificidad elevadas, su composición muy poco habitual los hacen inmunogénicos. La presente invención se refiere a la obtención de Abs que bien podrían proceder del sistema inmunitario humano y de este modo son probablemente menos inmunogénicos. Las bibliotecas de la presente invención retienen tantos restos procedentes de fusiones V-D-J o V-J como sea posible. Para reducir el riesgo de inmunogenicidad, puede ser prudente cambiar cada aminoácido que no sea de la línea germinal tanto en el marco como en las CDRs nuevamente a la línea germinal para determinar si el cambio desde la línea germinal es necesario para retener la afinidad de unión. De este modo, una biblioteca que está desviada en cada posición variada con respecto a la línea germinal reducirá la probabilidad de aislar Abs que tienen aminoácidos no necesarios que no son de la línea germinal.

Los Abs son proteínas grandes y están sujetos a diversas formas de degradación. Una forma de degradación es la desamidación de los restos Asn y Gln (especialmente en Ans-Gly o Gln-Gly) y la isomerización de restos de Asp. Otra forma de degradación es la oxidación de metioninas, triptófano, y cisteína. Otra forma de degradación es la escisión de dipéptidos Asp-Pro. Otra forma de degradación es la formación de piroglutamato a partir de Glu o Gln Nterminal. Es ventajoso proporcionar una biblioteca en la que se minimice la aparición de secuencias problemáticas.

Se proporcionan bibliotecas de vectores o paquetes que codifican miembros de una familia diversa de anticuerpos humanos que comprenden CDR3s de cadena pesada (HC) que tienen una longitud entre alrededor de 3 aminoácidos y alrededor de 35 aminoácidos. Las CDR3s de HC también pueden ser, en ciertas realizaciones, ricas en Tyr (Y) y Ser (S) , y/o comprometer regiones D diversificadas y/o comprometer regiones JH extendidas. Por ejemplo, las CDR3s de HC pueden contener más de alrededor de 40% (por ejemplo, entre alrededor de 43% y alrededor de 80%; por ejemplo, más de alrededor de 40% pero menos de alrededor de 100%) de restos Y y/o S, por ejemplo, como se proporciona en los ejemplos aquí. También se proporcionan bibliotecas focalizadas que comprenden tales CDR3s de HC. También se proporcionan diseños para CDR1 de HC, CDR2 de HC, y una biblioteca de VKIII A27 con diversidad en las CDRs. Una biblioteca de vectores o paquetes que codifica miembros de una familia diversa de anticuerpos humanos que comprenden CDR3s de HC descritos aquí puede tener además diversidad en una o más (por ejemplo, en una, dos o tres) de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC, y CDR3 de LC. Por ejemplo, la biblioteca puede tener diversidad en una o más (por ejemplo, en... [Seguir leyendo]

1. Una biblioteca de vectores o paquetes genéticos que presentan, presentan y expresan, o comprenden un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos y proteínas relacionados con anticuerpos humanos, y colectivamente presentan, presentan y expresan, o comprenden al menos una porción de la diversidad de la familia de anticuerpos, en la que los vectores o paquetes genéticos comprenden secuencias de ADN variegadas que codifican:

(i) una cadena pesada, que comprende:

(a) una CDR1 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: X31YX33MX35, en la que X31, X33 y X35 son cualquier aminoácido excepto Cys o Met;

(b) una CDR2 que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: X50IX52X52aSGGX56TX58YADSVKG, en la que X50, X52, X56 y X58 son cualquier aminoácido excepto Cys o Met, y X52a se selecciona del grupo que consiste en Gly, Ser, Pro o Tyr; y

(c) una CDR3;

y

(ii) una cadena ligera.

2. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ó 35 de las posiciones en la CDR3 de HC de la familia se varían entre los restos Tyr, Gly, Asp, Ser, y Arg, y en la que alrededor de 50% de todas las posiciones de la CDR3 de HC son Tyr, Gly, Asp, Ser, o Arg.

3. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ó 35 de las posiciones en la CDR3 de HC de la familia se varían entre los restos Tyr, Gly, Asp, Ser, y Arg, y en la que un resto Arg está presente en una región de relleno entre V y D, entre D y J, o entre V y J.

4. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la CDR3 de cadena pesada (HC) consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 35 restos, cada uno de los cuales varía independientemente entre los restos Tyr, Asn, Asp, Ser, y Arg, en la que una región del marco (FR) 3 está situada en el término amino de la CDR3, y una porción FR4 de una región JH está situada en el término carboxi de la CDR3; y en la que la FR3 es una FR3 de VH 3-23.

5. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que más de alrededor de 20% de la secuencia de CDR3 de HC consiste en restos de Tyr, y en la que las regiones D y los muñones J de la CDR3 de HC consisten en más de alrededor de 20% de restos de Tyr.

6. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que menos de alrededor de 20% de la secuencia de CDR3 de HC consiste en restos de Tyr, y en la que en las posiciones directrices o de relleno DJ de la CDR3 de HC consisten en menos de alrededor de 20% de restos de Tyr.

7. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la CDR3 de HC tiene tres aminoácidos de longitud y: el primer resto de la CDR3 de HC varía entre F, S, Y, D, y R en una relación 3:1:1:1:1; el segundo resto de la CDR3 de HC varía entre Q, E, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1:1; y el tercer resto de la CDR3 de HC varía entre H, D, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1:1, y en la que una FR3 está situada en el término amino de la CDR3, y el último resto de la FR3 varía entre K y R en una relación 3:1.

8. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la CDR3 de HC tiene una longitud de cuatro aminoácidos y: el primer resto de la CDR3 de HC varía entre L, S, Y, D, y R en una relación 4:1:1:1:1; el segundo resto de la CDR3 de HC varía entre L, S, Y, D, y R en una relación 4:1:1:1:1; el tercer resto de la CDR3 de HC varía entre W, S, Y, D, y R en una relación 4:1:1:1:1; y el cuarto resto de la CDR3 de HC varía entre F, S, Y, D, y R en una relación 4:1:1:1:1, y en la que una FR3 está situada en el término amino de la CDR3, y el último resto de la FR3 varía entre K y R en una relación 4:1.

9. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la CDR3 de HC tiene una longitud de dieciséis aminoácidos y: el primer resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el segundo resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el tercer resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el cuarto resto de la CDR3 de HC varía entre D, Y, S, R, y L en una relación 3:1:1:1:1; el quinto resto de la CDR3 de HC varía entre S, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el sexto resto de la CDR3 de HC varía entre S, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el séptimo resto de la CDR3 de HC varía entre G, A, S, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1:1:1; el octavo resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el noveno resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el décimo resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el undécimo resto de la CDR3 de HC varía entre

A, S, Y, R, y D en una relación 3:1:1:1:1; el duodécimo resto de la CDR3 de HC varía entre E, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1; el decimotercer resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el decimocuarto resto de la CDR3 de HC varía entre F, Y, S, R, y D en una relación 3:1:1:1:1; el decimoquinto resto de la CDR3 de HC varía entre Q, E, R, S, e Y en una relación 3:1:1:1:1; y el decimosexto resto de la CDR3 de HC varía entre H, E, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1:1, y en la que una FR3 está situada en el término amino de la CDR3, y el último resto de la FR3 varía entre K y R en una relación 3:1.

10. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la CDR3 de HC tiene una longitud de dieciséis aminoácidos y: el primer resto de la CDR3 de HC varía entre G, S, Y, D, R, y L en una relación 3:1:1:1:1:1; el segundo resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, D, R, y L en una relación 3:1:1:1:1; el tercer resto de la CDR3 de HC es C; el cuarto resto de la CDR3 de HC varía entre S, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el quinto resto de la CDR3 de HC varía entre S, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el sexto resto de la CDR3 de HC varía entre T, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el séptimo resto de la CDR3 de HC varía entre S, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el octavo resto de la CDR3 de HC es C; el noveno resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, D, R, y L en una relación 3:1:1:1:1; el décimo resto de la CDR3 de HC varía entre T, Y, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1; el undécimo resto de la CDR3 de HC varía entre A, S, Y, D, R, y L en una relación 3:1:1:1:1:1; el duodécimo resto de la CDR3 de HC varía entre E, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1; el decimotercer resto de la CDR3 de HC varía entre Y, S, D, R, y L en una relación 3:1:1:1:1; el decimocuarto resto de la CDR3 de HC varía entre F, Y, S, R, D, y L en una relación 3:1:1:1:1:1; el decimoquinto resto de la CDR3 de HC varía entre Q, E, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1:1; y el decimosexto resto de la CDR3 de HC varía entre H, D, R, S, Y, y L en una relación 3:1:1:1:1:1, y en la que una FR3 está situada en el término amino de la CDR3, y el último resto de la FR3 varía entre K y R en una relación 3:1.

11. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la cadena ligera es una cadena ligera (LC) A27,

en la que la CDR1 de LC está diversificada, en la que la posición 27 es alrededor de 55% de Q, y alrededor de 9% de cada uno de E, R, Y, S, y L; la posición 28 es alrededor de 46% de S y alrededor de 9% de cada uno de N, T, Y, E, R, y L; la posición 30 es alrededor de 55% de S y alrededor de 9% de cada uno de D, N, R, T, e Y; la posición 30a es alrededor de 46% de S y alrededor de 9% de cada uno de G, N, R, T, Y, y D, y alrededor de 8% con ningún aminoácido; la posición 31 es alrededor de 44% de S y alrededor de 8% de cada uno de D, F, G, N, R, T, e Y; la posición 32 es alrededor de 44% de Y y alrededor de 7% de cada uno de F, D, L, N, Q, R, S, e Y; y la posición 34 es alrededor de 70% de A y alrededor de 15% de cada uno de S e Y, y

en la que CDR2 de la LC está diversificada, en la que la posición 50 es alrededor de 55% de G, y alrededor de 9% de cada uno de D, R, S, Y, y L; la posición 53 es alrededor de 52% de S y alrededor de 8% de cada uno de N, T, S, Y, E, y R; y la posición 56 es alrededor de 64% de T y alrededor de 9% de cada uno de E, R, S, e Y.

12. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la cadena ligera es una cadena ligera (LC) A27,

en la que la CDR1 de LC está diversificada, en la que la posición 27 es alrededor de 55% de Q, y alrededor de 9% de cada uno de E, R, Y, S, y L; la posición 28 es alrededor de 46% de S y alrededor de 9% de cada uno de N, T, Y, E, R, y L; la posición 30 es alrededor de 55% de S y alrededor de 9% de cada uno de D, N, R, T, e Y; la posición 30a es alrededor de 46% de S y alrededor de 9% de cada uno de G, N, R, T, Y, y D, y alrededor de 8% con ningún aminoácido; la posición 31 es alrededor de 44% de S y alrededor de 8% de cada uno de D, F, G, N, R, T, e Y; la posición 32 es alrededor de 44% de Y y alrededor de 7% de cada uno de F, D, L, N, Q, R, S, e Y; y la posición 34 es alrededor de 70% de A y alrededor de 15% de cada uno de S e Y, y

en la que la CDR3 de LC está diversificada, en la que la posición 91 es alrededor de 64% de Y, y alrededor de 9% de cada uno de F, E, R, y S; la posición 92 es alrededor de 52% de G y alrededor de 8% de cada uno de A, D, R, S, T, e Y; la posición 93 es alrededor de 52% de S y alrededor de 8% de cada uno de D, F, N, R, T, e Y; la posición 94 es alrededor de 55% de S y alrededor de 9% de cada uno de W, E, R, Y, y S; la posición 95 es alrededor de 64% de P y alrededor de 9% de cada uno de E, R, Y, y S, y alrededor de 8% con ningún aminoácido; y la posición 96 es alrededor de 55% de L y alrededor de 9% de cada uno de E, R, P, Y, y S.

13. La biblioteca de la reivindicación 1, en la que la cadena ligera es una cadena ligera (LC) A27,

en la que la CDR2 de LC está diversificada, en la que la posición 50 es alrededor de 55% de G, y alrededor de 9% de cada uno de D, R, S, Y, y L; la posición 53 es alrededor de 52% de S y alrededor de 8% de cada uno de N, T, S, Y, E, y R; y la posición 56 es alrededor de 64% de T y alrededor de 9% de cada uno de E, R, S, e Y, y

en la que la CDR3 de LC está diversificada, en la que la posición 91 es alrededor de 64% de Y, y alrededor de 9% de cada uno de F, E, R, y S; la posición 92 es alrededor de 52% de G y alrededor de 8% de cada uno de A, D, R, S, T, e Y; la posición 93 es alrededor de 52% de S y alrededor de 8% de cada uno de D, F, N, R, T, e Y; la posición 94 es alrededor de 55% de S y alrededor de 9% de cada uno de W, E, R, Y, y S; la posición 95 es alrededor de 64% de P y alrededor de 9% de cada uno de E, R, Y, y S, y alrededor de 8% con ningún aminoácido; y la posición 96 es alrededor de 55% de L y alrededor de 9% de cada uno de E, R, P, Y, y S.

14. La biblioteca de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la cadena ligera tiene diversidad en una o más de CDR1 de LC, CDR2 de LC, y CDR3 de LC.

15. La biblioteca de la reivindicación 14, en la que la cadena ligera comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, o una CDR3 de LC de una LC de A27, en la que la CDR1 de LC está diversificada, en la que la posición 27 es alrededor de 55% de Q, y alrededor de 9% de cada uno de E, R, Y, S, y L; la posición 28 es alrededor de 46% de S y alrededor de 9% de cada uno de N, T, Y, E, R, y L; la posición 30 es alrededor de 55% de S y alrededor de 9% de 5 cada uno de D, N, R, T, e Y; la posición 30a es alrededor de 46% de S y alrededor de 9% de cada uno de G, N, R, T, Y, y D, y alrededor de 8% con ningún aminoácido; la posición 31 es alrededor de 44% de S y alrededor de 8% de cada uno de D, F, G, N, R, T, e Y; la posición 32 es alrededor de 44% de Y y alrededor de 7% de cada uno de F, D, L, N, Q, R, S, e Y; y la posición 34 es alrededor de 70% de A y alrededor de 15% de cada uno de S e Y; en la que la CDR2 de LC está diversificada, en la que la posición 50 es alrededor de 55% de G, y alrededor de 9% de cada uno 10 de D, R, S, Y, y L; la posición 53 es alrededor de 52% de S y alrededor de 8% de cada uno de N, T, S, Y, E, y R; y la posición 56 es alrededor de 64% de T y alrededor de 9% de cada uno de E, R, S, e Y, o en la que la CDR3 de LC está diversificada, en la que la posición 91 es alrededor de 64% de Y, y alrededor de 9% de cada uno de F, E, R, y S; la posición 92 es alrededor de 52% de G y alrededor de 8% de cada uno de A, D, R, S, T, e Y; la posición 93 es alrededor de 52% de S y alrededor de 8% de cada uno de D, F, N, R, T, e Y; la posición 94 es alrededor de 55% de S y alrededor de 9% de cada uno de W, E, R, Y, y S; la posición 95 es alrededor de 64% de P y alrededor de 9% de cada uno de E, R, Y, y S, y alrededor de 8% con ningún aminoácido; y la posición 96 es alrededor de 55% de L y alrededor de 9% de cada uno de E, R, P, Y, y S, o sus combinaciones.

16. Un método para preparar la biblioteca de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, comprendiendo el método titubeo digital.